Name: preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation at JoVE.com

Bu eser NIH CA109821 (TCC için) tarafından desteklenmiştir. Beckman Coulter cömertçe yayın maliyetlerini karşılamak için fon sağlamak için ve teknik yardım kurulum ve elutriation sisteminin çalışması için teşekkür ederiz. Biz Dr Fred Falkenburg ilk İlköğretim tüm kültürler için teşekkür ederiz.

Not: bu protokolü birincil B-tüm 13 µm (G2/M aşama) için yaklaşık 8 µm (G1 evresi) üzerinden çapı değişen hücreleri için optimize edilmiştir. Böylece, belirli santrifüj hızları ve pompa akış oranları farklı boyut aralıkları içeren hücreler için geçerli olmayabilir. Yine de, uygun elutriation parametreleri sedimantasyon hızı denklemi kullanarak tahmin edilebilir. Hücreleri tanımlanmış bir serum-Alerjik Orta olarak açıklanan 16 / 1-3 x 10 6 h?...

<ol>
	<li>Beach, D., Piper, M., Shall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+newly-initiated+DNA+from+the+early+S+phase+of+the+synchronous+eukaryote,+Physarum+polycephalum.">Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum.</a> Exp cell res. 129, 211-221 (1980).</li><li>Sevcikova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Completion+of+cell+division+is+associated+with+maximum+telomerase+activity+in+naturally+synchronized+cultures+of+the+green+alga+Desmodesmus+quadricauda.">Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda.</a> FEBS letters. 587, 743-748 (2013).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat protoc. 8, 602-626 (2013).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+cell+synchronization.">Overview of cell synchronization.</a> Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).</li><li>Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Mammalian+Cell+Cultures+by+Serum+Deprivation.">Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation.</a> Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).</li><li>Dulla, K., Margalef, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Mitotic+Cell+Synchronization.">Large-Scale Mitotic Cell Synchronization.</a> Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).</li><li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species.">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).</li><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation.">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat protoc. 3, 663-673 (2008).</li><li>Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+by+countercurrent+centrifugal+elutriation:+recent+developments.">Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments.</a> Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).</li><li>Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Yeast.">Synchronization of Yeast.</a> Meth mol. 1524, 215-242 (2017).</li><li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells?.">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?.</a> J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).</li><li>Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+cells+by+targeting+mitosis.">Killing cells by targeting mitosis.</a> Cell death diff. 19, 369-377 (2012).</li><li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+is+not+a+key+target+of+microtubule+agents+in+patient+tumors.">Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors.</a> Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).</li><li>Furst, R., Vollmar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+perspective+on+old+drugs:+non-mitotic+actions+of+tubulin-binding+drugs+play+a+major+role+in+cancer+treatment.">A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment.</a> Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).</li><li>Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-Dependent+Mechanisms+Underlie+Vincristine-Induced+Death+of+Primary+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells.">Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells.</a> Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).</li><li>Nijmeijer, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+primary+human+lymphoblastic+leukemia+cells+in+the+absence+of+serum+or+hematopoietic+growth+factors.">Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors.</a> Exp hematol. 37, 376-385 (2009).</li><li>Knudsen, E. S., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+mechanisms+for+the+inhibition+of+E2F+binding+to+RB+by+cyclin-dependent+kinase-mediated+RB+phosphorylation.">Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation.</a> Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).</li><li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cyclin-dependent+kinases.">Mammalian cyclin-dependent kinases.</a> Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).</li><li>Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitous+expression+and+cell+cycle+regulation+of+the+protein+kinase+PIM-1.">Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1.</a> Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).</li><li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+gene+encoding+a+tRNA+synthetase-like+protein+is+enhanced+in+tumorigenic+human+myeloid+leukemia+cells+and+is+cell+cycle+stage-+and+differentiation-dependent.">Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).</li><li>Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+response+to+cell+cycle+arrests+in+human+myeloid+leukemia+cells.">Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells.</a> eLife. 4, (2015).</li></ol>

CCE kullanarak hücre döngüsünün farklı aşamalarında tüm hücreleri birincil elde etmek için bir yöntem anlatmıştık. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus kolayca mükemmel verim elde edilebilir ve son derece S aşamasında zenginleştirilmiş hücreleri de istenirse edinilebilir. Sonuçları burada sunulan bir birincil tüm kültür (özellikle, ALL-5) ve temelde aynı sonuçlar elde edilen bağımsız bir kültür ile ...

Genellikle zaman uyumsuz olarak kültürlü hücrelerin büyümesine ve tek tek hücreler hücre döngüsünün farklı aşamalarında mevcuttur. Bazı organizmalar doğal olarak zaman uyumlu hücre döngüsü sergi veya belirli fizyolojik uyaranlar tarafından eşitlenebilir. Örneğin, bir çok zaman uyumlu moda1ve Desmodesmus quadricauda açık ve koyu alternatif tarafından senkronize edilebilir yeşil algler hücrelerinin çekirdekleri içinde sümük kalıp Physarum polycephalum dev plasmodia bölmek dönem2. Bu tür organizmalar benzersiz deneysel öznitelikleri sunarken, yeterli ölçüde memeli hücreleri karmaşıklığı modeli. Memeli hücre popülasyonlarının yapay olarak eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ve hücre döngüsü kontrol noktaları moleküler temeli ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak yöntemleri serum yoksunluğu, kimyasal blok ve yayın veya fiziksel özellikleri3,4istismar olabilir. Serum geri çekilmesi kez sendika girmek hücreleri neden olur ve yeniden ekleme serum G1 faz5hücre döngüsü iniş teşvik etmektedir. Kimyasal inhibitörleri aşırı timidin G1/S sınır hücreleri engellemek hidroksiüreye veya genellikle hücre M faz3,4tutuklama Mikrotubul inhibitörleri gibi ajanlar içerir. Mitotik sallamak-onlar Interphase hücreleri6' dan daha az yapışık olduğundan kullanılabilecek zenginleştirmek için Mitotik hücre dışı fiziksel özellikleri istismar bir yaklaşım içerir. Ancak, tüm bu tekniklerin potansiyel sakıncaları var. Örneğin, Mitotik sallamak-off olmadan önceki eşitleme Mitotik inhibitörleri ile sınırlıdır sonra tüm hücre tipleri canlılığı serum veya kimyasal inhibitörleri varlığı yokluğu ve hücreleri verimini korumak.
Nerede onlar7bölmek gibi hücreleri aşamalı olarak boyutu küçülür, erken embriyonik hücre döngüsü dışında çoğu hücre döngüsü boyunca ilerleyen büyüme fazları geçmesi ve daha büyük hale. Bu özellik boyut olarak farklı hücreleri ayırmak için kullanılan ve dolayısıyla Hücre döngüsünde8,9aşama kanatlı santrifüj elutriation (CCE), teknikte istismar edilir. CCE sırasında iki karşıt güç etkisi altında hücrelerdir: hücreler dönüş ekseni uzak sürücüler, merkezkaç kuvveti ve dönüş (şekil 1) eksenini karşı hücreleri sürücüler akışkan hızı (kanatlı),. Elutriation odası hücrelerde bu kuvvetlerin eşit olduğu bir denge konuma ulaşmak. Hücre çapı ve yoğunluk denge konumu dikte anahtar faktörlerdir. Akış Arabellek çözüm oranı artar ve kanatlı sürükle kuvvet merkezkaç kuvveti daha ağır basar, hücrelerin odası içinde konumunu bir değişiklik neden yeni bir denge kurulmuştur. Tüm hücreleri ise kanatlı oranı yeterince kendi çıkış tanıtmak için artış kadar büyük hücreleri odası içinde kal küçük olanlar öncelikle, oda bırakarak kaynaklanan odası çıkış doğru kaydırılır. Elutriation odası ardışık kanatlı oranı artış ile kaçan hücreleri belirli kesirler toplanabilir ve her kesir sırayla boyutları artan hücreler içerir. Artımlı kanatlı oranı artış ile elutriation iletken yerine, merkezkaç kuvveti tarafından Santrifüjü hızı azalan sıralı düşüşler aynı sonuca ulaşmak. Elutriation süreç optimizasyonu bağlı olarak hücre tipi, istihdam elutriation arabellek ve kullanılan belirli cihazları gerektirir. Bu koşullar altında hücre sedimantasyon oranı en iyi Stokes yasa ile anlatılan: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2r, nereye SV = sedimantasyon hızı; d = çap parçacık; Ρp = yoğunluğu parçacık; Ρm = yoğunluğu arabelleği; Η viskozite arabelleği; = Ω = açısal hızı Open End; ve r = parçacığın Radyal konumu. Böylece, SV hücre çapı ve yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve çapı ikinci kuvvetine yükseltilmiş beri daha da önemlisi hangi hücre döngüsünün genellikle sabittir yoğunluğu daha katkıda bulunur.
CCE önemli bir avantajı hücreleri kimyasal arıtma veya besin yoksunluğu sert koşullara tabi değil ve mükemmel verim aslında soğukkanlı kurtarılabilir olduğunu. Hücre döngüsü Travers olarak söz konusu hücreler çapı, en az % 30, önemli bir artış geçmesi zorunludur. Ana dezavantajı ise özel santrifüj, rotor ve aksesuarları maliyetidir. Yine de, hücreleri belirli hücre döngüsü aşamalarında CCE tarafından zenginleştirilmiş hazırlamak yeteneği büyük ölçüde hücre döngüsü araştırma memeli hücreleri9,10üzerinden Maya organizmalarda kolaylaştırdı. Ayrıca, son gelişmeler kullanır üzerinden kanserli doku, farklı hücre tipleri heterojen karışımları ve belirli hücre tiplerinin immünoterapi9üretim için ayrılması karşı sağlıklı hücreleri ayırma için arttırıyoruz.
Bizim büyük ilgi ajanlar (MTAs) Cezayir menekşesi alkoloidler ve taxanes gibi hedefleme Mikrotubul hareket mekanizması anlamakta olmuştur. Bu ilaçların iğ Mikrotubul işlevi11,12, engelleme sadece mitoz içinde hareket düşünüldü ama onlar da Interphase mikrotübüller13,14hedefleyebilir son kanıtlar gösteriyor. Biz son zamanlarda birincil Akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücreleri ya da ölümde G1 evresi geçmesi veya M yılında vincristine ve hücre döngüsü bağlı şekilde15dakika sonra diğer MTAs ile tedavi ederken aşama bildirdi. Farklı hücre döngüsü aşamaları CCE tarafından tüm hücreler ayrı yeteneği bu sonuca ulaşmada vesile oldu. Bu makalede, biz teknik ayrıntıları açıklamak ve CCE uygulamaya İlköğretim hazırlanması için pratik ipuçları tüm hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında sunuyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1542">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">10-508Q</td>
			<td style="width:780px;">1 L bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">Fetal Plus bovine serum</td>
			<td style="width:108px;">Atlas Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">FP-0500-A</td>
			<td>500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt</td>
			<td style="width:108px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">212-672-4</td>
			<td>100 g powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">50 mL concial tubes</td>
			<td style="width:108px;">Denville Scientifics</td>
			<td style="width:119px;">C1062-P</td>
			<td>500/case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">PES Membrane 0.22 &#181;m filter unit</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGP033RB</td>
			<td>250/pack</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">B14544</td>
			<td>centrifuge compatible with elutriation system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">JE 5.0 elutriator rotor kit</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">356900</td>
			<td>rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chamber, standard, 4-mL, &#34;A&#34;</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">356943</td>
			<td>standard elutriation chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex L/S Easy-Load pump head</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07518-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex L/S Variable-Speed Drive</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-07528-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16</td>
			<td style="width:108px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:119px;">EW-96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">25 G x 1.5 Precision Glide needle</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305127</td>
			<td>sterile, single-use needles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">10 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td>sterile, single-use syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">Vi-Cell XR</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">383556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">PI/RNase staining buffer</td>
			<td style="width:108px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">550825</td>
			<td>propidium iodide/RNase staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody</td>
			<td style="width:108px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody</td>
			<td style="width:108px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-20044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:108px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">8516s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:535px;">GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:108px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">2118s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">170-6516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:535px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">170-6515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary acute lymphoblastic leukemia cells in different cell cycle phases by centrifugal elutriation

Hücreleri eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak teknikler istihdam serum yoksunluk içerir; hücreleri farklı hücre döngüsü aşamaları tutuklama kimyasallar; veya Mitotik sallamak-hangi azaltılmış onların bağlılık yararlanan kapalı kullanımı. Ancak, tüm bu dezavantajları var. Örneğin, serum açlık normal hücreleri için iyi ama daha az tümör hücreleri nedeniyle onkogen harekete geçirmek ya da Tümör baskılayıcı kaybı güvenliği aşılan hücre döngüsü kontrol noktaları ile iyi çalışır. Benzer şekilde, kimyasal tedavi hücre popülasyonlarının ilaçla zarar liman ve stres ile ilgili değişiklikler gösterir. Hangi bu sorunları circumvents bir akışlı santrifüj elutriation (CCE), nerede hücreleri iki karşıt güç, merkezkaç kuvveti ve hücre boyutu ve yoğunluğu temelinde ayrılması sonucunda sıvı hız tabi tekniktir. Hücreler arasında geçiş yapma genellikle ilerleyen büyütmek, CCE hücreler farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için kullanılabilir. Burada birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri için bu tekniği uygulamak. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus içinde mükemmel verim elde edilebilir. Bu hücre popülasyonlarının ideal eğitim hücre döngüsü bağlı mekanizmaları eylem antikanser ilaçların ve diğer uygulamalar için uygundur. Biz de nasıl değişiklikler standart bir prosedür olabilir suboptimal performansa yol göstermek ve teknik sınırlamaları tartışıyorlar. Sunulan ayrıntılı metodoloji uygulama ve araştırma tekniği hücreleri diğer türleri için kolaylaştıracaktır.

Birincil tüm hücreleri (3-4 10 x8) için santrifüj elutriation tabi ve toplanan iki yıkama kesirler ve yirmi ana kesirler, iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Tablo 1 nerede her kesir hem de karşılık gelen rotor hızı toplam sayısı sunulmaktadır temsilcisi verileri gösterir. Genel olarak verim genellikle üzerinde % 80 oldu. Bu hücre çapı elutriation (Şekil 2) ilerleyen ile artan bireysel kesirler hücre çapı ölçümü do...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation at JoVE.com

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

The overall goal of this procedure, is to isolate cells into different cell cycle phases using centrifugal elutriation. This method can help answer key questions in the cancer therapeutics field. Because the isolation of cells into separate phases, allows for the interrogation of phase dependent affects of anti-cancer compounds.The main advantage of this technique is that it allows for separation of cells into specific phases using physical properties, rather than chemical perturbations. To start the experiment, install the strobe assembly into the centrifuge such that the power cord is fed out of the chamber through the port on the left. Adjust the strobe flash lamp so that it lines up with the viewing window, when the centrifuge is closed.Secure the assembly in place, by tightening two phillips head screws, at the top of each bracket. And then by tightening the thumb screws at the bottom of the bracket. Plug the power cord into the strobe power port, located at the back of the centrifuge.Next, set the rotors straight down onto the centrifuge drive hub, and firmly secure it with a T handle hex wrench. Then, place the assembly containing the elutriation chamber, counterbalance, rotating seal assembly, and a mounting plate onto the rotor. Push down evenly, placing one hand on the elutriation chamber, and the other hand on the counterbalance, until the bolts on the rotor snap into place.Place the pin, located at one end of the cable, into the hole in the rotating seal assembly. And secure the eyehole, at the other end, with one of the phillips head screws, affixed onto the bracket to connect the anchoring cable. To assemble the flow system, to pump buffer into and out of the elutriation chamber, connect size 16 tubing to a variable speed pump.Insert one free end of this tubing through a port at the top left of the centrifuge chamber, such that it enters into the chamber. Attach a fitting to the free end of this tube, and then insert the fitting into the input hole of the rotating seal assembly. Lastly, insert the output tubing, through a port, to attach it to the transfer tube at the top of the rotating seal assembly.Once the elutriation system is assembled, sterilize it by placing the other free end of the input tubing into a 500 milliliter bottle, filled with 5%bleach. And placing the output tubing into an empty one liter waste bottle. Next, turn on the pump, and allow the bleach to flow all the way through the elutriation system, until it is pumped out into the waste bottle.Now, turn the centrifuge on and allow it to come to the maximum designated speed to release bubbles and back pressure. Once the set speed is reached, stop the centrifuge. After the rotor has stopped completely, open the lid and inspect the chamber for any leaks.Next, in a similar fashion, as previously described, run sterile water through the system for 10 minutes. After flushing with water, replace the water reservoir with a sterile glass bottle filled with 100 milliliters of elutriation buffer. Place the input tubing into this bottle, so that it is at the very bottom.Start the centrifuge, and allow the buffer to flow through the system. After the reservoir bottle is close to empty, and water is fully flushed out of the system, move the output tubing from the waste bottle into the reservoir so that buffer is continuously recycled through the system. Finally, switch on the strobe lamp, and turn the elutriation knob to the extreme left.Now, adjust the viewing window by slowly turning the knob to the right, so that the elutriation chamber is clearly seen, and the strobe light is in sync with the rotor's speed. Prepare the cell sample as described in the text protocol. Add the resuspended cells into the reservoir bottle containing the recycling elutriation buffer.Allow the cells to enter into the system and reach equilibrium within the elutriation chamber. To ensure that all cells are retained in the chamber, take a drop of the eluent on a glass slide, and view it under a microscope. If the sample is devoid of intact cells, it confirms the retention in the chamber.Once all the cells have entered into the chamber, and a distinct boundary at the whitest part of the chamber, containing cells and equilibrium is seen, begin collecting fractions. Move the output tubing to a pre-chilled 50 milliliter conical tube, labeled W1.Collect 50 milliliters of elutriation buffer in this tube and store on ice. Soon after collecting the W1 fraction, lower the centrifuge speed to 821 G.And move the output tube to the conical tube, labeled W2, and collect 50 milliliters more at this speed.Continue changing the speed, and collecting fractions. Make sure there is medium in the reservoir tank, and always store the collected fractions on ice. After all fractions have been collected, stop the centrifuge, and collect 50 milliliters in a conical tube, labeled stop.Pellet cells collected in each of the fractions, and using downstream analysis, such as flow cytometry, or western blotting, as required. A line graph displaying the average diameter of cells in successive elutriation fractions, is shown. Note that the larger the cell diameter, the higher the fraction number at which it elutes.Results from fluorescents activated cells sorting analysis, show the DNA content of cells in each of the 20 elutriation fractions. Early fractions, F1 to F5, contain almost exclusively cells with 2N DNA content representing cells in G1 phase. A mixture of cells in G1 and S phases, was seen in intermediate fractions, F6 to F9.And cells with 4N DNA content, representing cells in G2 to M, were observed starting in F10.Shown here, are western blot results from probing the levels of cell cycle related proteins in pooled fractions of cells in G1 phase, and G2 to M phase. The G2 to M Pool had higher levels of Phospho-Rb and Cyclin B one, compared to the G1 Pool, as expected. Cyclin D one signal was weak, but nonetheless was detectable in the G1 Pool, and undetectable in the G2 to M Pool.Once mastered, this technique can be done in three hours if it is performed properly. While attempting this procedure, it is important to remember to take your time, and make sure that the elutriation system is assembled properly, and that all materials and solutions are prepared. Following this procedure, other methods such as cell cycle analysis, cell viability assays and immunoblots can be performed in order to interrogate how therapeutic compounds may be acting in a cell cycle phase dependent manner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Kanser Araştırmaları

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...