Name: processing of human cardiac tissue toward extracellular matrix self-assembling hydrogel for in vitro and in vivo applications
Uploaded: 2017-12-04T14:00:00
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研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に準拠しています。患者組織の研究目的のための使用のためのインフォームド コンセントの提供し、組織を収集するプロセスは、制度検討委員会とシャリテ ・ ベルリン Universitätsmedizin (EA4/028/12) の倫理委員会によって承認されました。

研究プロトコルは、ヘルシンキ宣言に記載されている倫理原則に適合し、シャリテ医科大学施設内審査委員会および倫理委員会で承認されました。提供されるすべての患者は、実験的研究のための中心のティッシュの使用のためのインフォームド・コンセント書かれて。
1. ひと心筋の区分のための準備
<ol><li>左室心筋を取得 (サイズは、手術の種類によって異なります)...

<ol>
	<li>Elliott, R., Hoehn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Commercial+Porcine+Skin+for+Wound+Dressings.">Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings.</a> Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).</li><li>Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Extracellular+Matrix:+An+Ever-Changing+and+Diverse+Entity.">Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity.</a> Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).</li><li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. 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W., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+zebrafish+cardiac+extracellular+matrix+induces+mammalian+heart+regeneration.">Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration.</a> Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).</li><li>Godier-Furn&#233;mont, A. F. G., Martens, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+scaffold+provides+a+cell+delivery+platform+for+cardiovascular+repair.">Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).</li><li>Sarig, U., Sarig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+myocardial+ECM+patch+drives+cardiac+progenitor+based+restoration+even+after+scarring.">Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring.</a> Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).</li><li>Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering.">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li></ol>

目標は次を達成するために、ヒトの心筋 ECM を準備するとき: 免疫細胞の関連資料、ECM の整合性と生理、不妊、最終製品、GMP プロセス互換性の非毒性の保全の除去と処理の面で特定のアプリケーションのための製品の適合性。微粒子や自己組織化ハイドロゲルにさらなる処理と私たち 3 段 decellularization プロトコルを組み合わせて、人間の心臓の ECM 材料が得られ、特定の生物学的作用を有し?...

細胞外マトリックス (ECM) だけでなく構造サポートが、生物の細胞にとっても重要ですし、組織機能1を提供します。中心部に線維化、炎症、血管新生、心筋収縮機能、生存率、および居住者の前駆細胞の運命などの病態生理学的応答の調節における ECM が参加しています。その主要なコンポーネント - 線維性糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン - に加えて分泌された成長因子、サイトカイン、および核酸, 蛋白質の2,の3を含む膜小胞のホストが含まれます。
最近、無細胞性 ECM 準備がだけ潜在的な治療上のセル ベースのアプリケーションにとっても、細胞マトリックスの相互作用を研究するため非常に貴重ではないこと明確ななっています。治療細胞製品、エンジニア リング組織に適切な環境を提供することの重要性が広く認められています。定義された biopolymeric ゲル4,5,6またはマウス肉腫細胞 (すなわちマトリゲル、Geltrex) から分泌されるタンパク質カクテル細胞懸濁液または活性化合物を結合する試みがなされました。7しますただし、元の生物活性を限られている、後者は GMP グレード プロセスで問題が発生、心臓 ECM (cECM)8,9,10,の組織固有活性の両方に欠ける。11,12,13。
心筋の decellularization は以前冠血管14,15を介して心臓全体の灌流によって行われています。これは動物の心で可能ですが、そのまま人間の心はほとんどあります。したがって、手術で得られた組織のサンプルを処理することができます浸漬プロセスが支持されました。私たちの「3 ステップ」プロトコルは、別の 3 を含んでいるインキュベーション手順すなわち溶解、可溶化、および DNA 除去。それは主に保存されタンパク質とグリコサミノグリカンの構成16,17ヒト心筋 ECM を得られます。これらの cECM スライス体外細胞マトリックスの相互作用の研究を可能にするが、悪い潜在的な人間のスケールの治療への応用に適しています。製造工程、凍結乾燥 cECM 微粒子または cECM ハイドロゲル18生成に延長されました。
このプロトコルは、心筋細胞外マトリックス (ECM) とその生物学的活性の主要なコンポーネントを維持、手術標本から得られるひと心筋の decellularization を使用できます。保存された組織固有の生物活性を持つヒトの心臓 ECM が細胞マトリックスの相互作用に関する実験的研究に必要な場合、または細胞を用いた心筋再生のアプローチに適した環境が必要な場合は、このプロトコルをお勧めします。原則として、処理された cECM の使用は、実現可能な将来の治療への応用をする必要がありますにも GMP グレードの条件このプロトコルに適応する可能です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>DR Precisa, Dietikon, Switzerland</td>
			<td>Precisa XR 205SM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades Nr.10 Skalpell Nr.3</td>
			<td>InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany</td>
			<td>SK-10-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates (6-well)</td>
			<td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat CM</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>8043.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml)</td>
			<td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>616201, 623201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15ml, 50ml</td>
			<td>Greiner, Frickenhausen, Germany</td>
			<td>188271, 227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrome, Berlin, Germany</td>
			<td>S 0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry System</td>
			<td>Labconco, Kansas City, USA</td>
			<td>7670520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-80&#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>Forma 900 Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>281.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Blades Type 819</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>14035838925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys Homogeniser</td>
			<td>PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany</td>
			<td>91-PCSM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>K021.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P06-07800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td>P6887-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Keramik-Kit 1.4 mm</td>
			<td>Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany</td>
			<td>91-PCS-CK14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotamax 120 Plate shaker</td>
			<td>Heidolph, Schwabach, Germany</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td>M125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP, 0,22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stuart analogue rocker &#38; roller mixers</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td>Z675113-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek O.C.T compound</td>
			<td>Hartenstein, Wurzburg, Germany</td>
			<td>TTEK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfusion set 200&#181;m</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td>798.200.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>5429.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm</td>
			<td>Medical Highlights, Rohrdorf, Germany</td>
			<td>CV102-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie2</td>
			<td>Scientific Industry, New York, USA</td>
			<td>SI-0256</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

processing of human cardiac tissue toward extracellular matrix self-assembling hydrogel for in vitro and in vivo applications

無細胞性細胞外マトリックス製剤は細胞マトリックスの相互作用を研究するために役立ち、再生細胞療法の適用を容易にします。ゲルまたは膜として商業細胞外マトリックスのいくつかの製品がありますが、これらは組織固有の生物学的活性を持っていません。灌流 decellularization は通常は人間の心臓組織で可能でないために、浸漬 3 段 decellularization プロセスを開発しました。手術中に調達した人間の心筋スライスは最初イオン洗剤、ドデシル硫酸と孵化によって続いて洗剤無料高浸透圧換散バッファーと扱われ、固有の DNase 活性を利用することで完了です。ウシ胎児血清。この手法による心臓の細胞外マトリックスの細胞シートで残されて線維組織のアーキテクチャと生体高分子の組成を示した心臓細胞と多能性幹に特定の環境手がかりを提供するにはセルです。心臓の細胞外マトリックス シート、さらにさらに化学修飾することがなく微粒子粉末に加工したり、短期のペプシン消化経由で自己組織化心臓細胞外マトリックス ハイドロゲルに保存生体活性。

ひと心筋の decellularization の 3 ステップのプロトコルは、ECM のキーコンポーネントと ECM の高次構造を維持しながら細胞材料のほぼ完全な除去の結果を掲載します。Decellularization 後、組織からの細胞の総除去 (図 1 a) の色の変化によって明白であります。H & E とマッソン Trichrome 汚れと組織学的分析では、そのまま残留細胞 (図 1 b</...

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Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

このプロトコルでは、その細胞外マトリックス成分を維持しながらひと心筋の完全な decellularization について説明します。さらに微粒子と胃酸の自己組織化ハイドロゲルの生産における細胞外マトリックスの結果の処理。

ひと心筋細胞外マトリックスの in VitroとIn Vivo応用のハイドロゲルを自己組織化に向けての処理

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

インスリン産生細胞への分化のためのラット脂肪組織間葉系幹細胞の単離

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

下垂体幹細胞生物学を探るための In Vitro モデルとしてのマウス下垂体からのオルガノイドの開発

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...