Name: megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’Australian Health and Medical Research Council (projet subvention 1012409 liée au BHC).

Ce protocole a été approuvé par la South Eastern Sydney Human Research Ethics Committee et ratifiée par le University of New South Wales' Human Research Ethics Committee. Sang de cordon ombilical provenant de donneurs sains a été fourni par le cordon sang Bank de Sydney (Sydney, NSW, Australie). Volumes d’environ 100 mL ont été utilisés pour cette procédure.
NOTE : Les travaux dans une placard à l’aide d’une technique aseptique de biosécurité classe II. Décontaminer l’ex...

<ol>
	<li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation.">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li><li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+(TPO)+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells.">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li><li>Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis:+State+of+the+Art.">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li><li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional.">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation,+transcriptional+activity+and+platelet+production.">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li><li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34+CD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage.">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells:+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution.">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li><li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+thrombocytopenia:+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro.">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li><li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia:+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count.">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li><li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells.">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li><li>Lu, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice.">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li><li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming.">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208 (2016).</li><li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells:+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood.">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+proplatelet+elaboration.">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).</li><li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34++cells.">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).</li><li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds.">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li><li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34+-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand.">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li><li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation,+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1/S+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation.">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li><li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+Immune+Thrombocytopenia.">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li><li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+thrombocytopenic+purpura:+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management.">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li></ol>

Le protocole décrit ici est adapté pour une production constante de MK et de plaquettes dans la culture du sang de cordon ombilical. Ces cellules peuvent servir à étudier les divers processus tels que l’effet de drogues ou d’activités biologiques sur MK prolifération, différenciation, proplaquettes formation et production de plaquettes.
Une variété de combinaisons de cytokines et de milieux de culture ont été présentés dans la littérature. Addition de cytokines telles que le ...

Isolement d’un nombre suffisant de mégacaryocytes humains primaires (MK) pour une utilisation régulière de laboratoire n’est pas possible en raison de leur faible fréquence dans la moelle osseuse, où ils représentent ~0.01% de cellules nucléées1. Une alternative commode est l’ex vivo de l’expansion et la différenciation des souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices en présence de facteurs de croissance spécifiques. Un certain nombre de cytokines dont stem cell factor (SCF ; c-kit ligand) et interleukine (IL) -3 et IL-11 ont été utilisés dans les systèmes de culture pour produire MKs. thrombopoïétine (TPO) est le facteur de croissance et la différenciation plus efficace pour les cultures megakaryocytic et est efficace seul ou avec d’autres cytokines, telles que le SCF et l’IL-32. TPO peut agir sur les populations de cellules souches se traduire par la prolifération et la maturation de MKs2.
Plaquettes produits MK de protubérances cytoplasmiques appelées proplaquettes et, in vivo, environ 1 x 1011 plaquettes sont formés tous les jours pour soutenir les numérations plaquettaires de 150-400 x 109/l. plaquettes production in vitro est jusqu'à 1000 -plier plus bas que in vivo estime à3, et cela a donné lieu à nombreuses conditions de culture à l’aide de CD34+ cellules progénitrices hématopoïétiques pour améliorer MK et plaquettes production in vitro. La source initiale de CD34+ cellules utilisées pour la différenciation MK était de sang périphérique humain4. Autres sources de cellules incluent la moelle osseuse5,6, les cellules souches embryonnaires et induits pluripotentes cellules souches (ESC/iPSC)7et cordon ombilical sang (UCB)8,9,10 . La moelle osseuse humaine CD34+ 11 et la souris lignée négative la moelle osseuse des cellules5 produits MK et plaquettes in vitro; Néanmoins, le manque de disponibilité de la moelle osseuse humaine limite son utilisation comme source de CD34+ cellules. En revanche, ESC et iPSC représentent une source illimitée de cellules pour la production de plaquettes in vitro . Production de plaquettes de ces cellules nécessite des cellules nourricières tels que les cellules murines OP9 et de plus longues périodes de culture. Plaquettes dérivées dans des conditions sans chargeur semblent être moins fonctionnel12. iPSC-dérivé des plaquettes sont susceptibles d’être d’utilisation en milieu clinique, puisqu’ils peuvent être étendus à grande échelle. Ce processus nécessite transduction LENTIVIRAUX médiée par des facteurs de transcription et à long terme de la culture de cellule13.
UCB est une source accessible de CD34+ cellules qui peuvent être facilement utilisés dans les paramètres de recherche. TPO seul peut favoriser la différenciation du cordon de dérivés du sang CD34+ cellules et cela donne lieu à MKs extrêmement pur, mature sans besoin de supplémentation de sérum ou de co-culture avec des cellules nourricières. Autres cytokines telles que le SCF peut diminuer la différenciation de l’UCB CD34+ cellules, tandis que Flt-3 ligand et IL-11 favorisent la production de mégacaryocytes immatures14. Ce protocole décrit la production de cultures de MK très pures de sang de cordon ombilical CD34+ cellules dans des conditions de milieu sans sérum.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM II</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td>Serum-free media for CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Isolation Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td>This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies</td>
			<td>1114545</td>
			<td>Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile separation buffer (SB)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry and Cell Staining Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340669</td>
			<td>Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347464</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349044</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340929</td>
			<td>Final antibody concentration 1:5 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse anti-Human CD42b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551061</td>
			<td>This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1227A647T</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA928A647</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6994</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 mouse anti-humna CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>58425</td>
			<td>1: 20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>580373</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAC1-FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340507</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD62p mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6632</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11020</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ig Isotype Control cocktail-C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558659</td>
			<td>Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Counting beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Smaller and larger columns are also commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>In Vitro technologies</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRB inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Diva Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell analysis software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2 blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells

Production de plaquettes se produit principalement dans la moelle osseuse dans un processus appelé Thrombopoïèse. Au cours de la Thrombopoïèse, cellules progénitrices hématopoïétiques différencient aux précurseurs de plaquettes de forme appelés mégacaryocytes, qui se différencient en phase terminale pour libérer les plaquettes des processus longs cytoplasmiques appelés proplaquettes. Mégacaryocytes sont rares cellules confinés à la moelle osseuse et sont donc difficiles à récolter en nombre suffisant pour utilisation en laboratoire. Une production efficace de mégacaryocytes humaines peut être obtenue in vitro en cultivant CD34+ des cellules dans des conditions appropriées. Le protocole détaillé ici décrit l’isolement des CD34+ cellules par cellule magnétique de tri des échantillons de sang de cordon ombilical. Les mesures nécessaires pour produire des mégacaryocytes extrêmement purs, matures dans des conditions sans sérum sont décrites. Détails des analyses phénotypiques de la différenciation du mégacaryocyte et détermination des proplaquettes production formation et plaquettes sont également fournis. Effecteurs qui influencent la différenciation mégacaryocyte et/ou formation proplaquettes, tels que les anticorps antiplaquettaires ou mimétiques de la thrombopoïétine, peuvent être ajoutés à des cellules cultivées à examiner la fonction biologique.

Ce protocole permet la préparation de cultures très pures de MK de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Le pourcentage de CD34+ des cellules dans le cordon sang est d’environ 1,3 %15 (Figure 1 a) et le nombre total de cellules mononucléées (étape 1.8) s’étend de 90-300 x 106 unitaire de l’UCB. La pureté du CD34 + / CD45 + cellules après isolement s’étend de 90 à 99 % (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Une population très pure de mégacaryocytes peut provenir de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Une méthode pour CD34+ la différenciation des cellules d’isolement et mégacaryocyte est décrite ici.

Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Génération de cellules T régulatrices induites de l&#39;homme primaires cellules T naïves et mémoire

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Recherche

Immunologie et infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

L&#39;isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Dans modèle de différenciation in Vitro des cellules de la mémoire humaine normale B à longue durée de vie des cellules de Plasma

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...