Name: megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Författarna erkänner stöd av australiska hälsa och medicinska forskningsrådet (projekt grant 1012409 kopplade till BHC).

Detta protokoll godkändes av South Eastern Sydney mänsklig forskning etikkommitté och ratificerats av i University of New South Wales' mänskliga forskningsetisk kommitté. Navelsträngsblod från friska donatorer lämnades av den Sydney navelsträngsblod Bank (Sydney, NSW, Australien). Volymer av cirka 100 mL användes för detta förfarande.
Obs: Fungera i en klass II biosäkerhet skåp med aseptisk teknik. Sanera utsidan av sladd blod påsen med 70% etanol. Använd sterila instrument (sa...

<ol>
	<li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation.">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li><li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+(TPO)+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells.">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li><li>Reems, J. -. A., Pineault, N., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Production+and+Platelet+Biogenesis:+State+of+the+Art.">In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).</li><li>Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+in+vitro+from+proplatelet-displaying+human+megakaryocytes+are+functional.">Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional.</a> Blood. 85 (2), 402-413 (1995).</li><li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monopartite+sequence+is+essential+for+p45+NF-E2+nuclear+translocation,+transcriptional+activity+and+platelet+production.">A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production.</a> J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).</li><li>Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profile+of+primary+human+CD34+CD38lo+cells+differentiating+along+the+megakaryocyte+lineage.">Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage.</a> Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).</li><li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li><li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+megakaryocyte+differentiation+of+fresh+and+ex-vivo+expanded+cord+blood+cells:+rapid+and+transient+megakaryocyte+reconstitution.">In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution.</a> Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).</li><li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+thrombocytopenia:+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro.">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li><li>Lev, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+proplatelet+formation+in+immune+thrombocytopenia:+a+novel+mechanism+contributing+to+decreased+platelet+count.">Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count.</a> Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).</li><li>Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+for+generating+platelet-like+fragments+from+megakaryocytic+cell+lines+and+human+progenitor+cells.">A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells.</a> Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).</li><li>Lu, S. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+generated+from+human+embryonic+stem+cells+are+functional+in+vitro+and+in+the+microcirculation+of+living+mice.">Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice.</a> Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).</li><li>Moreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+megakaryocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+by+chemically+defined+forward+programming.">Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming.</a> Nature Commun. 7, 11208 (2016).</li><li>De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+megakaryocyte+progenitor+cells:+cord+blood+versus+mobilized+peripheral+blood.">Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood.</a> Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).</li><li>Nimgaonkar, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+CD34++cells+in+cord+blood.">A unique population of CD34+ cells in cord blood.</a> Stem cells. 13 (2), 158-166 (1995).</li><li>Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+proplatelet+elaboration.">Mechanics of proplatelet elaboration.</a> J Thromb Haemost. 5, 18-23 (2007).</li><li>Matsunaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+large-scale+generation+of+human+platelets+from+cord+blood+CD34++cells.">Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells.</a> Stem cells. 24 (12), 2877-2887 (2006).</li><li>Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+continuous+in+vitro+human+platelet+production+using+three-dimensional+scaffolds.">Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds.</a> Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).</li><li>Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ex+vivo+expansion+of+megakaryocytes+from+human+cord+blood+CD34+-enriched+cells+in+the+presence+of+thrombopoietin+and+limiting+amounts+of+stem+cell+factor+and+Flt-3+ligand.">Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand.</a> J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).</li><li>Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+megakaryocytes+do+not+complete+maturation,+as+indicated+by+impaired+establishment+of+endomitosis+and+low+expression+of+G1/S+cyclins+upon+thrombopoietin-induced+differentiation.">Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation.</a> Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).</li><li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+Immune+Thrombocytopenia.">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li><li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+thrombocytopenic+purpura:+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management.">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li></ol>

Protokollet beskrivs här är lämplig för konsekvent produktion av MK och trombocyter i kultur från navelsträngsblod. Dessa celler kan användas för att studera olika processer såsom effekten av läkemedel eller biologiska aktiviteter på MK proliferation, differentiering, proplatelet bildning och trombocytantal produktion.
En mängd kultur media och cytokin kombinationer har presenterats i litteraturen. Tillägg av cytokiner såsom stamceller faktor, Flt-3 ligand, IL-3 och IL-6 stöder ...

Isolering av ett tillräckligt antal primära mänskliga megakaryocyter (MK) för regelbundna laboratoriebruk är inte möjlig på grund av deras låga frekvens i benmärgen, där de står för ~0.01% av kärnförsedda celler1. Ett bekvämt alternativ är ex vivo expansion och differentiering av hematopoetiska stamceller och stamceller i närvaro av specifika tillväxtfaktorer. Ett antal cytokiner inklusive stamceller faktor (SCF; c-kit-ligand) och interleukin (IL) -3 och IL-11 har varit är anställd i kultur system att producera MKs. Thrombopoietin (TPO) den mest effektiva tillväxt och differentiering faktorn för megakaryocytic kulturer och är effektiv ensam eller med andra cytokiner, såsom SCF och IL-32. TPO kan agera på stem cellpopulationer att resultera i både spridning och mognaden av MKs2.
MK produkter trombocyter från cytoplasmiska utbuktningar kallas proplatelets och, in vivo ca 1 x 1011 trombocyter är är bildas dagligen för att upprätthålla trombocytantal 150-400 x 109/l. trombocytantalet produktion i vitro upp till 1000 -Vik lägre än den i vivo uppskattar3, och detta har gett upphov till många kultur förhållanden med hjälp av CD34+ hematopoetiska progenitorceller att förbättra MK och trombocytantal produktion i vitro. Ursprungliga källan av CD34+ celler som används för MK differentiering var humant perifert blod4. Andra cell-källor är benmärgen5,6, embryonala stamceller/inducerade pluripotenta stamceller (ESC/iPSC)7och navelsträngen blod (UCB)8,9,10 . Mänsklig benmärg CD34+ 11 och mus härstamning negativa benmärg celler5 råvaror MK och trombocyter in vitro; Trots bristen på tillgänglighet av mänsklig benmärg begränsar dess användning som en källa av CD34+ celler. Däremot representerar ESC och iPSC en obegränsad källa av celler för in vitro- produktion av trombocyter. Trombocytantal produktionen från dessa celler kräver feeder celler murina OP9 och kultur längre. Trombocyter härrör i feeder-fria förhållanden verkar vara mindre funktionella12. iPSC-derived trombocyter är sannolikt att vara av användning i kliniska inställningar eftersom de kan utökas till stor skala. Denna process kräver lentiviral-medierad transduktion transkriptionsfaktorer och långsiktiga cell kultur13.
UCB är en lättillgänglig källa av CD34+ celler som lätt kan användas i forskning inställningar. TPO ensam kan främja differentiering av sladd blod-derived CD34+ celler och detta ger upphov till högt rena, Mogen MKs utan behov av serum tillskott eller samtidig kultur med feeder celler. Andra cytokiner såsom SCF kan minska differentiering från UCB CD34+ celler, medan Flt-3 ligand och IL-11 främja produktionen av omogna megakaryocyter14. Det här protokollet beskriver produktionen av högt rent MK kulturer från navelsträngsblod CD34+ celler i serumfritt villkor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Culture Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM II</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>9605</td>
			<td>Serum-free media for CD34+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Isolation Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 MicroBead kit ultrapure</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-453</td>
			<td>This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies</td>
			<td>1114545</td>
			<td>Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile separation buffer (SB)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry and Cell Staining Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340669</td>
			<td>Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347464</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349044</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-Human CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340929</td>
			<td>Final antibody concentration 1:5 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse anti-Human CD42b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551061</td>
			<td>This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA1227A647T</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA928A647</td>
			<td>Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6994</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 mouse anti-humna CD41a</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>58425</td>
			<td>1: 20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>580373</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAC1-FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340507</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD62p mouse monoclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6632</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11020</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ig Isotype Control cocktail-C</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558659</td>
			<td>Isotype control antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Counting beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Smaller and larger columns are also commercially available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>In Vitro technologies</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRB inverted microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Vert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Canto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin centrifuge</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>Cytospin 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell analyser software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACS Diva Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell analysis software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 2 blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

megakaryocyte differentiation and platelet formation from human cord blood-derived cd34+ cells

Trombocytantal produktion uppstår huvudsakligen i benmärgen i en process som kallas thrombopoiesis. Under thrombopoiesis skilja hematopoetiska stamceller att bilda trombocyter prekursorer kallas megakaryocyter, som obotligt gör åtskillnad mellan för att släppa trombocyter från länge cytoplasmiska processer kallas proplatelets. Megakaryocyter är sällsynta celler begränsad till benmärgen och är därför svåra att skörda i tillräckligt antal för laboratoriebruk. Effektiv produktion av mänskliga megakaryocyter kan vara uppnådda i vitro genom odling CD34+ celler under lämpliga betingelser. Protokollet beskrivs här beskriver isolering av CD34+ celler av magnetiska cell sortering från navelsträngen blodprov. Nödvändiga åtgärder för att producera mycket ren, Mogen megakaryocyter serumfritt villkor beskrivs. Detaljer av fenotypiska analys av megakaryocyt differentiering och bestämning av proplatelet bildning och trombocytantal produktion finns också. Effektorer som påverkar megakaryocyt differentiering eller proplatelet bildande, såsom trombocythämmande antikroppar eller trombopoetin mimetika, kan läggas till odlade celler att undersöka biologisk funktion.

Detta protokoll tillåter framställning av högt rent MK kulturer från sladd blod-derived CD34+ celler. Procentandelen av CD34+ celler i sladd blod är ca 1,3%15 (figur 1A) och det totala antalet mononukleära celler (steg 1,8) varierar från 90-300 x 106 UCB styck. Renhet av CD34 + / CD45 + celler efter isolering varierar från 90 till 99% (figur 1B). MK (definieras som ...

Watch this Scientific Journal Video about Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells at JoVE.com

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

En mycket ren population av megakaryocyter kan erhållas från sladd blod-derived CD34+ celler. En metod för CD34+ isolering och megakaryocyt celldifferentiering beskrivs här.

Megakaryocyt differentiering och trombocytantal Formation från mänskliga sladd blod-derived CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinisk tillämpning av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Konstgjord och antigenpresenterande celler för att genetiskt modifiera T celler från perifert och navelsträngsblod

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Realtid avbildning av heterotypisk blodplättar-neutrofila interaktioner på aktiverat endotel Under vaskulär inflammation och blodproppsbildning i levande möss

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Isoleringen, differentiering och kvantifiering av human antikropp-utsöndrande B-celler från blod: ELISpot som en funktionell Avläsning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells iTregs from NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve CD4+ T Cells Using a TGF-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-containing Protocol

In vitro-differentiering av humana CD4 + Foxp3 + Induced regulatoriska T-celler (iTregs) från naiva CD4 + -T-celler med ett TGF-β-innehållande protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Isolering, Expansion och adipogena induktion av CD34 + CD31 + Endothelial celler från mänskliga Omental och subkutan fettvävnad

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

I Vitro differentiering modell av människans normala minne B celler att långlivade plasmaceller

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...