Name: expression of exogenous antigens in the mycobacterium bovis bcg vaccine via non-genetic surface decoration with the avidin-biotin system
Uploaded: 2018-01-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System at JoVE.com

Vi tackar Dr. R Stokes för BCG Pasteur stammen och A. Talal för teknisk support. Vi tackar också GenScript för hjälp med gen syntes.

Alla djur var underhålls i enlighet med protokoll som godkänts av djur vård och användning kommittéer vid University of British Columbia. Experiment godkändes av djur vård och användning kommittéer och utförs enligt kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer. Antalet djur assurance välfärd är A11-0247.
1. generering av monomer metoden fusionsproteinerna uttrycker plasmider
<ol><li>Sub klona monomer avidinen sekvens12 in i pDEST17 plasmid mellan platser...

<ol>
	<li>Horwitz, M. A., Harth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vaccine+against+tuberculosis+affords+greater+survival+after+challenge+than+the+current+vaccine+in+the+guinea+pig+model+of+pulmonary+tuberculosis.">A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.</a> Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).</li><li>Pym, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+BCG+exporting+ESAT-6+confers+enhanced+protection+against+tuberculosis.">Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis.</a> Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).</li><li>Grode, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vaccine+efficacy+against+tuberculosis+of+recombinant+Mycobacterium+bovis+bacille+Calmette-Guerin+mutants+that+secrete+listeriolysin.">Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin.</a> The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).</li><li>Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Mycobacterium+bovis+BCG.">Recombinant Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).</li><li>Mederle, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmidic+versus+insertional+cloning+of+heterologous+genes+in+Mycobacterium+bovis+BCG:+impact+on+in+vivo+antigen+persistence+and+immune+responses.">Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses.</a> Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).</li><li>Singh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity+A+Novel+Approach+to+Cancer+Immunotherapy+Tumor+Cells+Decorated+with+CD80+Generate+Effective+Antitumor+Immunity.">A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity.</a> Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).</li><li>Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+requirements+for+enhanced+antigen+cross-presentation+to+CD8+cytotoxic+T+lymphocytes.">Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes.</a> J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).</li><li>Sharif-Paghaleh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+efficacy+of+dendritic+cell+vaccination+by+early+detection+of+(99m)+Tc-HMPAO-labelled+CD4(+)+T+cells.">Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells.</a> Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria.">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).</li><li>Laitinen, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+an+active+avidin+monomer.">Rational design of an active avidin monomer.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).</li><li>Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+interferon+gamma+in+resistance+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).</li><li>Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+immunogenicity+of+the+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccine+by+non-genetic+bacterial+surface+decoration+using+the+avidin-biotin+system.">Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin-biotin+technology+in+targeted+therapy.">Avidin-biotin technology in targeted therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).</li><li>Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunotherapy+of+brain+tumor.">Radioimmunotherapy of brain tumor.</a> Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).</li><li>Cummings, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+plant-produced+recombinant+monomer+hemagglutinin-based+influenza+vaccine+derived+from+influenza+A+(H1N1)pdm09+virus:+a+Phase+1+dose-escalation+study+in+healthy+adults.">Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults.</a> Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).</li><li>Kolotilin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-based+solutions+for+veterinary+immunotherapeutics+and+prophylactics.">Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics.</a> Vet Res. 45, 114-117 (2014).</li><li>Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+engineering+of+streptavidin+monomer+with+a+reduced+biotin+dissociation+rate.">Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate.</a> Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).</li><li>Deghmane, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoamide+dehydrogenase+mediates+retention+of+coronin-1+on+BCG+vacuoles,+leading+to+arrest+in+phagosome+maturation.">Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation.</a> J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).</li><li>Soualhine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+bovis+bacillus+Calmette-Guerin+secreting+active+cathepsin+S+stimulates+expression+of+mature+MHC+class+II+molecules+and+antigen+presentation+in+human+macrophages.">Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages.</a> J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).</li><li>Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+antibodies+to+avidin+in+human+serum.">Natural antibodies to avidin in human serum.</a> ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).</li><li>Petronzelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+avidin+is+not+hampered+by+antiavidin+antibodies+in+humans.">Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans.</a> Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).</li><li>Bigini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+of+avidin-nucleic+acid+nanoassemblies+as+multifunctional+diagnostic+tools.">In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools.</a> ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).</li></ol>

I denna studie rapporterade vi en icke-genetiska strategi för snabb och effektiv visning av exogena proteiner på BCG yta att lägga till antingen specifika antigener eller specifika funktionella egenskaper förväntas effektivt förbättra bakteriens immunogenicitet. Vi visat att BCG cellytan kunde vara enkelt biotinylerade för momentana yta dekoration med metoden fusionsproteinerna. Den totala proceduren kan utföras inom 2 h, medan genetisk transformation och urval av positiva kloner kräver 2 till 3 månaders efter...

Olika strategier har föreslagits att ersätta nuvarande TB Vaccinet BCG, inklusive protein adjuvant system, viral vektoriserade teknik, försvagat levande M.tb stammar och genetiskt modifierade BCG stammar, antingen för att introducera gener över uttrycker BCG antigener som inte uttrycks tillräckligt under infektion1 eller Mtb-specifika antigener inte förekommer i BCG2. Genteknik, står dock inför många hinder inklusive osäker nivå av säkerhet, tidsödande och låga effektivitet av uttrycket vektorer4,5. När det gäller att förbättra BCG, behövs en alternativ metod att förbättra immunogenicitet utan behov av osäkra genetiska växlingen.
I denna studie introducerar vi en ny strategi för visning av rekombinanta proteiner av intresse på BCG cellytan som baseras på välkända hög affinitet metoden interaktionen med biotin. Denna metod tillåter snabba och reproducerbara fastsättning av rekombinant avidinen fusionsproteiner på ytan av biotinylerade BCG, vilket underlättar bred manipulationer av BCG att uppnå maximal förbättring av dess effektivitet samtidigt som dess utmärkt säkerhet rekord, observerade under decennier av användning.
Avidinen affinitet för biotin är extremt hög (Kd = 10−15 M) och en gång bildats, biotin-avidinen komplexet är mycket stabil och kan endast störas under denatureringen villkor6. För denna typ av interaktion att fungera som en gen överföring metod alternativ, krävs dock långsiktigt men reversibel visning av rekombinanta proteiner. Således, introducerade vi här en låg affinitet monomer metoden (Kd = 10−7 M) som leder till reversibel frisläppandet av protein från ytan inredda BCG intas en gång inuti antigenpresenterande celler. För att ge ett proof of concept, testade vi denna metod använder en monomer metoden chimära protein motsvarar ett surrogat antigen härrör från äggalbumin (OVA)7,8. Resultaten visade att BCG cellens yta kan vara snabbt och enkelt dekorerad med monomer metoden fusionsproteinerna och att denna bindning till BCG ytan är stabila och reproducerbara utan påvisbara förändringar i bakteriell tillväxt och överlevnad. Också, Vi hittade att BCG dekorerad med monomer avidinen smält med ägg (AviOVA) kan framkalla ett immunsvar som liknar den som induceras av BCG genetiskt uttrycker samma antigen både in vitro- och in vivo. Denna teknik av vändbar display av proteiner av intresse på bakteriell ytan är därför en effektiv ersättning av traditionella gen överföring tillvägagångssätt och kan tillhandahålla en plattform för bred manipulationer av BCG och mer ytterligare applikationer i vaccin utveckling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1046">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:531px;">Endotoxin-free RPMI 1640</td>
			<td style="width:229px;">StemCell Technologies&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">36750</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfo-NHS SS biotin</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">21328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-conjugated streptavidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer&#160;</td>
			<td>MBL International&#160;</td>
			<td>TS-M710-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON polyhistidine-Tag purification resin&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">635501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:229px;">BD Bioscience&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">557681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AF647 rat anti-mouse IFN-g</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">557735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AF647 rat anti-mouse I-A/I-E</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">562367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PeCy7 rat anti-mouse CD4</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">552775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE rat anti-mouse CD8 Ab</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">AF 647 rat anti-mouse H-2kb&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">562832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:531px;">FITC-conjugated goat anti rabbit antibody</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:531px;">AF 647 rat anti-mouse CD4</td>
			<td style="width:229px;">BD Bioscience&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">557681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Middlebrook 7H9 broth&#160;</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:531px;">OADC</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td style="width:119px;">B11886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 80</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW 264.7 murine macrophage cell lines&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pDEST17 plasmid&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11803012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-OVA plasmid&#160;</td>
			<td>GenScript</td>
			<td style="width:119px;">SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP clonase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11789020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LR clonase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11791043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:531px;">pDONR221 plasmid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12536017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ni-NTA columns&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce protein concentrators&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">88527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flurosave</td>
			<td>Calbiochem-Novabiochem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axioplan II epifluorescence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD digital camera&#160;</td>
			<td>Retiga EX, QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tecnai G2 200kV electron microscope&#160;</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td style="width:119px;">G2 200Kv&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m Falcon cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">87712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EasyStep mouse biotin positive selection kit&#160;</td>
			<td>StemCell</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:531px;">biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody</td>
			<td style="width:229px;">BioLegend</td>
			<td align="right" style="width:119px;">116203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brefeldin A</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytofix/Cytoperm kit&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bright-Glo Luciferase assay system</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">e2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Turner Biosystem luminometer&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">TD-20/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica EM UC6 microtome</td>
			<td style="width:229px;">&#160;Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Novalyphe NL 500 freeze dryer</td>
			<td style="width:229px;">Savant Instruments</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NL 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton boroscilicate glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">&#160;VWR 66011-675</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of exogenous antigens in the mycobacterium bovis bcg vaccine via non-genetic surface decoration with the avidin-biotin system

Tuberkulos (tbc) är en allvarlig infektionssjukdom och den enda tillgängliga vaccin M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) är säkra och effektiva skyddsåtgärder mot barnens svåra TB meningit och vissa former av disseminerad TB, men misslyckas med att skydda mot pulmonell tuberkulos, som är den vanligaste formen av sjukdomen. Lovande strategier för att förbättra BCG för närvarande förlitar sig antingen på sin omvandling med gener som kodar för immundominant M. tuberkulos (Mtb)-specifika antigener eller komplettering med gener som kodar för co-faktorer som skulle stimulera antigen presenterande celler. Stora begränsningar för dessa metoder inkluderar låg effektivitet, låg stabilitet och den osäkra säkerhetsnivån av uttrycket vektorer. I denna studie presenterar vi ett alternativ till vaccin förbättring, som består av BCG komplettering med exogena proteiner av intresse på ytan av bakterier, i stället för transformation med plasmider kodning motsvarande gener. Först, proteiner av intresse uttrycks i fusion med monomer metoden i standard E. coli uttryck system och sedan används för att dekorera ytan av biotinylerade BCG. Djurförsök med BCG surface dekorerad med surrogat äggalbumin antigen Visa att den modifierade bakterien fullt immunogent och kan framkalla specifika T-cell svar. Sammantaget stöder de data som presenteras här starkt en ny och effektiv metod för att omforma den nuvarande BCG-vaccination som ersätter den mödosamma konventionell metoden av komplettering med exogena nukleinsyror.

Med de allmänna förfaranden som beskrivs ovan, undersöktes genomförbarheten av BCG ytan biotinylation och dekoration med surrogat antigen OVA. Immunogeniciteten för den modifierade BCG var sedan testas i vivo. Bakteriella ytan var enkelt märkt med biotin för snabb visning av metoden chimära antigener utan påvisbara förändringar i bakteriell fenotyper. Den resulterande modifierade BCG förtärs effektivt av antigen-presentation celler och kan framkalla en OVA-specifikt ...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System at JoVE.com

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Ny teknik för snabb antigen visning på en bakteriell yta presenteras, som innebär att ytan biotinylation följt av exponering för proteiner av intresse i fusion med monomer metoden. Laddar BCG med valda antigener framgångsrikt förbättrar dess immunogenicitet, vilket tyder på att ytan dekoration kan ersätta traditionella genetiska metoder.

Uttryck av exogena antigen i Mycobacterium bovis BCG vaccinet via icke-genetiska yta dekoration med metoden-biotin systemet

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

En funktionell helblodsanalys att mäta livskraft mykobakterier, med hjälp av Reporter-Gene taggade BCG eller M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Uttryck av Functional rekombinant hemagglutinin och neuraminidas Proteiner från Novel H7N9 influensavirus Använda baculovirusexpressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃƒÅ½Ã‚ÂµRI

Utveckling av ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modellsystem för att studera interaktionen mellan<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE med sin högaffinitetsreceptor FcsRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE-baserad analys för att studera migration av dendritiska Murin hudceller i dränerande lymfkörtlar under infektion med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Rening av membran facket för endoplasmatiska nätverket-associerade nedbrytningen av exogena antigen i Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Imaging Mycobacterium tuberculosis hos möss med Reporter enzym fluorescens

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...