Name: determining genome-wide transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts at JoVE.com

HAC रीता एलेन फाउंडेशन (http://www.ritaallenfoundation.org) के मिल्टन ई. Cassel विद्वान थे । इस काम के लिए अनुदान से HAC को राष्ट्रीय जनरल चिकित्सा विज्ञान केंद्र के उत्कृष्टता अनुदान P50 GM071508 (P.I. डेविड Botstein), PhRMA फाउंडेशन ग्रांट 2007RSGl9572, नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट ओसीआई-१०४७८७९ से दाऊद अगस्त, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM081686, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज R01 GM0866465, द एली & #38; Edythe व्यापक केंद्र के पुनर्अपक्षय चिकित्सा & #38; स्टेम सेल अनुसंधान, आईरिस खिचड़ी भाषा महिला स्वास्थ्य केंद्र के UCLA CTSI NIH ग्रांट UL1TR000124, और ल्यूकेमिया लिंफोमा सोसायटी । इस प्रकाशन में दी गई अनुसंधान सूचना राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के पुरस्कार संख्या P50CA092131 के अंतर्गत समर्थित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी । HAC का सदस्य है एली & #38; Edythe व्यापक केंद्र के पुनर्अपक्षय चिकित्सा & #38; स्टेम सेल अनुसंधान, ucla आणविक जीवविज्ञान संस्थान, और ucla Bioinformatics विभागीय कार्यक्रम ।

सभी प्रयोगों के प्रिंसटन विश्वविद्यालय और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित किए गए थे ।
1. ActD समय पाठ्यक्रम के लिए Proliferating और संपर्क-बाधित Fibrob...

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	<li>Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+multiple+pathways+for+unique+regulation+of+mRNA+decay+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).</li><li>Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes.">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).</li><li>Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+during+T+cell+activation:+alternate+regulation+of+mRNA+transcription+and+mRNA+stability.">Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability.</a> BMC Genomics. 6, 75 (2005).</li><li>Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decay+rates+of+human+mRNAs:+correlation+with+functional+characteristics+and+sequence+attributes.">Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes.</a> Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).</li><li>Hao, S., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+of+mRNA+influences+the+temporal+order+of+the+induction+of+genes+encoding+inflammatory+molecules.">The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules.</a> Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).</li><li>Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+description+of+cellular+quiescence.">A new description of cellular quiescence.</a> PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).</li><li>Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cap-to-tail+guide+to+mRNA+turnover.">The cap-to-tail guide to mRNA turnover.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).</li><li>Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highways+and+byways+of+mRNA+decay.">The highways and byways of mRNA decay.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).</li><li>Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+network+regulates+proliferative+timing+and+extracellular+matrix+synthesis+during+cellular+quiescence+in+fibroblasts.">A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts.</a> Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).</li><li>Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+degradation+controls+differentiation+state-dependent+differences+in+transcript+and+splice+variant+abundance.">mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance.</a> Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).</li><li>Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).</li><li>Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+changes+in+mRNA+stability+contribute+to+quiescence-specific+gene+expression+patterns+in+a+fibroblast+model+of+quiescence.">Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence.</a> BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).</li><li>Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. 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S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gene+expression+measurements+from+commercial+microarray+platforms.">Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms.</a> Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Wong, M. L., Medrano, J. 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D., Messiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+splice+variants+using+real-time+PCR.">Quantification of splice variants using real-time PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).</li><li>Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetics+of+mammalian+gene+expression.">The kinetics of mammalian gene expression.</a> Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).</li><li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).</li><li>Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+globally+activates+microRNA+biogenesis.">Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+principles+of+mammalian+transcriptional+regulation+revealed+by+RNA+half-life.">Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).</li><li>Soeiro, R., Amos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+half-life+measured+by+use+of+actinomycin+D+in+animal+cells+-+A+caution.">mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).</li><li>Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+mRNA+decay:+methodologies,+pathways,+and+links+to+other+stages+of+gene+expression.">Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression.</a> J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).</li><li>Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+half-life+measurements+in+mammalian+cells.">Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells.</a> Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).</li><li>Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+diversifies+post-transcriptional+regulation+by+selective+RNA-protein+interactions.">Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).</li><li>Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+mRNA+isoform+half-lives+reveals+stabilizing+and+destabilizing+elements+in+yeast.">Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast.</a> Cell. 156 (4), 812-824 (2014).</li><li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anchor-away+technique:+rapid,+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes.">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).</li><li>Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+dynamics+of+microRNAs+revealed+by+a+novel+pulse-chase+approach.">Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach.</a> Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).</li></ol>

weak mitogens या सीरम, सेल आसंजन की कमी, और संपर्क निषेध की वापसी सहित बाहरी संकेतों से प्रेरित किया जा सकता है । संपर्क निषेध, weak उत्प्रेरण के लिए एक से अधिक संभव तरीकों में से एक, सेल के लिए सेल संपर्क के जवाब में ?...

टेप के स्थिर राज्य स्तर दोनों प्रतिलिपि संश्लेषण और प्रतिलिपि क्षय के योगदान को प्रतिबिंबित । विनियमित और समन्वित प्रतिलिपि क्षय जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है1,2,3,4. उदाहरण के लिए, प्रतिलिपि क्षय दर भड़काऊ cytokine ट्यूमर परिगलन कारक द्वारा सक्रियण के बाद की घटनाओं के लौकिक श्रृंखला में योगदान करने के लिए दिखाया गया है5.
हम पहले से पता चला है कि प्रसार और प्राथमिक मानव fibroblasts में weak के बीच संक्रमण कई जीन6के प्रतिलिपि स्तर में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है । इन परिवर्तनों में से कुछ इन दोनों राज्यों के बीच प्रतिलेखन कारकों की गतिविधि में अंतर को प्रतिबिंबित ।
एक प्रतिलिपि क्षय की दर में परिवर्तन भी दो विभिंन राज्यों में एक प्रतिलिपि के अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन के लिए योगदान कर सकते है7,8। हमारे पहले के निष्कर्षों के आधार पर है कि प्रसार और weak के बीच संक्रमण के कई microRNAs के स्तर में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है9, हमने पूछा कि क्या वहां भी परिवर्तन में अंतर प्रतिलिपि क्षय से एक योगदान है जीन proliferating बनाम quiescent fibroblasts में अभिव्यक्ति.
आदेश में प्रतिलिपि स्थिरता की निगरानी के लिए, हम टेप जीनोम के क्षय की दर निर्धारित proliferating बनाम quiescent कोशिकाओं में व्यापक । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम proliferating बनाम quiescent fibroblasts में क्षय दर नए प्रतिलेखन के एक अवरोधक शुरू करने और दर जिस पर व्यक्तिगत टेप समय पर गायब हो निगरानी द्वारा मॉनिटर । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि, के रूप में तरीके कि बस समग्र जीन अभिव्यक्ति की निगरानी की तुलना में, नई प्रतिलिपि संश्लेषण बाधा से, हम इन टेप के लिए क्षय दर निर्धारित करने में सक्षम होंगे दर से अलग है जिस पर वे कर रहे है लिखित.
ActD उपचार के लिए नए प्रतिलेखन को बाधित और प्रतिलिपि क्षय दर निर्धारित सफलतापूर्वक कई पिछले अध्ययन में लागू किया गया है । ActD की प्रतिलिपि में परिवर्तन में आरएनए स्थिरता का महत्व टुकड़े के लिए इस्तेमाल किया गया है कि समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के साथ उपचार से परिणाम5. एक समान दृष्टिकोण भी proliferating बनाम विभेदित C2C12 कोशिकाओं में प्रतिलिपि क्षय दर में मतभेद टुकड़े इस्तेमाल किया गया है के रूप में वे एक विभेदित मांसपेशियों phenotype10। एक अंय उदाहरण के रूप में, ग्लोबल mRNA आधा जीवन भी pluripotent और विभेदित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं11में पाया गया है । इन उदाहरणों में, mRNA क्षय के लिए प्रलेखित बहुतायत विनियमन और कोशिकाओं के विभिंन सेल राज्यों के संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है ।
तरीकों को लागू करने के नीचे वर्णित है, हम लगभग ५०० जीन में प्रतिलिपि क्षय दर में परिवर्तन की खोज की जब proliferating और quiescent राज्यों में fibroblasts की तुलना12। विशेष रूप से, हमें पता चला कि microRNA मीर-29, जो quiescent कोशिकाओं में downregulated है के लक्ष्यों को स्थिर कर रहे है जब weak के लिए कोशिकाओं को संक्रमण । हम यहां पद्धति का वर्णन हम proliferating और quiescent कोशिकाओं में क्षय दर निर्धारित किया करते थे । यह पद्धति वैश्विक mRNA क्षय दर दो अलग लेकिन समान स्थितियों में तुलना के लिए उपयोगी है जब तेजी से क्षय जीन के बारे में जानकारी मांगी है । यह भी ऐसे प्रतिलिपि क्षय पर सेल संस्कृति की स्थिति के प्रभाव के रूप में अंय सवालों के समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, दो आयामी बनाम तीन आयामी संस्कृतियों में । क्षय दर microarrays या आरएनए-Seq जैसे तरीकों के साथ जीनोम-वाइड निर्धारित किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, वास्तविक समय qPCR या उत्तरी सोख्ता एक जीन द्वारा-जीन या isoform-by-isoform आधार पर क्षय दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन दरों में तो प्रत्येक मॉनिटर जीन के आधे जीवन की गणना करने के लिए और क्षय की दर है कि दो स्थितियों में अलग है के साथ जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:809px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4&#176;C</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Equipment for running agarose gels</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile tissue culture plates and conical tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-118</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">35-010-CV</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td style="width:237px;">For decontaminating work surfaces from RNase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">2.0 ml eppendorf tubes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Trypsin-EDTA&#160; Solution 10X</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002-07-07</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:291px;">Sterile PBS</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-250</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Trizol</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15596018</td>
			<td style="width:237px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1410-2 mg</td>
			<td style="width:237px;">inhibits transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Sterile DMSO</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31-761-00ML</td>
			<td style="width:237px;">solvent for actinomycin D</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN19400225</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2618500</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP28184</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0551</td>
			<td style="width:237px;">carrier for RNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:291px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1907</td>
			<td style="width:237px;">removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,&#160; inactivates DNA and removes divalent cations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Agarose</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICN820721</td>
			<td style="width:237px;">MP Biomedicals, Inc product</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Loading dye for RNA gel</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0641</td>
			<td style="width:237px;">suitable even for denaturing electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Millenium RNA markers</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
			<td style="width:237px;">RNA ladder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">One-color RNA Spike-in Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technology</td>
			<td style="width:119px;">5188-5282</td>
			<td style="width:237px;">Example spike-in control for Agient microarray analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Tris base</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP152-1</td>
			<td style="width:237px;">molecular biology grade, for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A38-500</td>
			<td style="width:237px;">for TAE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">EDTA</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120-500</td>
			<td style="width:237px;">electrophoresis grade, for gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:163px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td style="width:237px;">for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4456740</td>
			<td style="width:237px;">Spike-in control for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">RS-122-2101</td>
			<td style="width:237px;">for RNA Seq</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">96-well 0.3 ml PCR plate</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-0600</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Microseal B adhesive seals</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89094-662</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps</td>
			<td style="width:163px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM12230</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">SuperScript Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18090010</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td style="width:237px;">for real-time qPCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining genome-wide transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts

weak एक अस्थायी, प्रतिवर्ती अवस्था है जिसमें कोशिकाएं कोशिका विभाजन की स्थिति में रहती हैं, लेकिन पैदा की क्षमता को बनाए रखती हैं । हमारे सहित कई अध्ययनों, प्रदर्शन किया है कि weak जीन अभिव्यक्ति में व्यापक परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है । इनमें से कुछ परिवर्तन E2F और MYC जैसे प्रसार-संबद्ध प्रतिलेखन कारकों के स्तर या गतिविधि में परिवर्तन के माध्यम से होते हैं । हमने प्रदर्शन किया है कि mRNA क्षय भी proliferating और quiescent कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए योगदान कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम मानव चमड़े की चमड़ी fibroblasts की proliferating और quiescent संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रक्रिया का वर्णन । हम तो Actinomycin डी (ActD) के साथ proliferating और quiescent कोशिकाओं में नए प्रतिलेखन बाधा के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन । ActD उपचार प्रतिलिपि क्षय से dissociating नए प्रतिलेखन के लिए एक सीधा और प्रतिलिपि दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । ActD उपचार का एक नुकसान यह है कि समय पाठ्यक्रम एक कम समय सीमा तक सीमित किया जाना चाहिए क्योंकि ActD कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित करता है । प्रतिलिपि स्तर समय पर नजर रखी है प्रतिलिपि क्षय दर निर्धारित करते हैं । इस प्रक्रिया जीन और isoforms कि proliferating बनाम quiescent fibroblasts में अंतर क्षय प्रदर्शन की पहचान के लिए अनुमति देता है ।

हम पहले proliferating और संपर्क में प्रतिलिपि क्षय दर के microarray विश्लेषण के परिणामों की सूचना दी है एक 8 घंटे का समय पाठ्यक्रम12पर प्राथमिक मानव fibroblasts बाधित । प्रतिलिपि में एक महत्वपूर्ण परिवर्...

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Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

हम proliferating और quiescent प्राथमिक मानव चमड़े का fibroblasts पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, प्रतिलिपि क्षय दर की निगरानी, और विभेदक क्षय जीन की पहचान ।

Proliferating और Quiescent मानव Fibroblasts में जीनोम चौड़ा प्रतिलिपि क्षय दरों का निर्धारण

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

पर हौसले अलग मानव विलस Cytotrophoblasts siRNA अभिकर्मक और EMSA विश्लेषण

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मानचित्रण जीनोम-वाइड सुलभ क्रोमेटिन प्राथमिक मानव टी लिम्फोसाइटों में ATAC-Seq द्वारा

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Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

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एक कोशिका आनुवंशिक तकनीक का उपयोग कर बेमिसिया टैबची के अंडे निषेचन दर का निर्धारण

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

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