Name: structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace
Uploaded: 2017-10-16T14:00:00
Duration: 11 min 6 s
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गति विधि Dupree समूह (कैंब्रिज विश्वविद्यालय, यूके) के विभिंन सदस्यों द्वारा वर्षों से विकसित और अनुकूलित किया गया था, और हम उनके सभी योगदान की सराहना करते हैं । यह काम डो संयुक्त जैव ऊर्जा संस्थान (http://www.jbei.org) के भाग के रूप में वित्त पोषित किया गया था अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, जैविक और पर्यावरणीय अनुसंधान के कार्यालय, अनुबंध DE-AC02 के माध्यम से-05CH11231 के बीच लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला और ऊर्जा विभाग के यू. एस. हम भी थीा उठाओ और csla9 नमूने तैयार करने के साथ मदद के लिए Vy एनजीओ धंयवाद ।

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+A+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Mortimer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Cell+Wall+Polysaccharides+Using+PACE.">Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE.</a> Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).</li><li>Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+glycosyl+hydrolases+and+biofuels:+a+natural+marriage.">Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage.</a> Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).</li><li>Mortimer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+xylan+in+Arabidopsis+primary+cell+walls+is+synthesised+by+GUX3,+IRX9L,+IRX10L+and+IRX14.">An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14.</a> Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).</li><li>Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+relative+quantitation+using+isotope+tagging+and+normal-phase+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).</li><li>Busse-Wicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Xylan+Substitution+Patterns+in+Gymnosperms+and+Angiosperms:+Implications+for+Xylan+Interaction+with+Cellulose.">Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose.</a> Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).</li><li>Mortimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+branches+from+xylan+in+Arabidopsis+gux+mutants+reveals+potential+for+simplification+of+lignocellulosic+biomass.">Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).</li><li>Anders, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyl+transferases+in+family+61+mediate+arabinofuranosyl+transfer+onto+xylan+in+grasses.">Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).</li><li>Goubet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+glucomannan+in+Arabidopsis+is+synthesised+by+CSLA+glycosyltransferases,+and+influences+the+progression+of+embryogenesis.">Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis.</a> Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+That+GH115+alpha-Glucuronidase+Activity,+Which+Is+Required+to+Degrade+Plant+Biomass,+Is+Dependent+on+Conformational+Flexibility.">Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility.</a> J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+complexity+dictates+microbial+resource+allocation+in+the+large+intestine.">Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine.</a> Nat Commun. 6, 7481 (2015).</li><li>Handford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localisation+and+characterisation+of+cell+wall+mannan+polysaccharides+in+Arabidopsis+thaliana.">Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana.</a> Planta. 218 (1), 27-36 (2003).</li><li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+stage-based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis:+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants.">Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants.</a> Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Carbohydrate Active Enzyme Database. , (2017).</li><li>Hogg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+architecture+of+Cellvibrio+japonicus+mannanases+in+glycoside+hydrolase+families+5+and+26+points+to+differences+in+their+role+in+mannan+degradation.">The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation.</a> Biochem J. 371, 1027-1043 (2003).</li><li>Brennan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+microbial+xylanases+from+insect+guts.">Unusual microbial xylanases from insect guts.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+high+throughput+carbohydrate+profiling+technique+for+analyzing+plant+cell+wall+polysaccharides+and+carbohydrate+active+enzymes.">Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 6, (2013).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

पेस निस्र्पक polysaccharide संरचना के लिए एक सीधी विधि है । यह किसी भी polysaccharide के लिए लागू किया जा सकता है जिसके लिए वहां विशेषता गतिविधि के साथ GHs ज्ञात कर रहे हैं, साहित्य में कई उदाहरण देखें1,6,9,11। टीटी भी उपंयास GHs12,13,18 और glycosyltransferases9के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू किया गया है, परिभाषित polysaccharide सब्सट्रेट और स्वीकार करने का उपयोग करके ।
प्रतिलिपि, व्याख्यात्मक परिणाम तीन महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर हैं । सबसे पहले, इस्तेमाल किया GHs प्रदूषित गतिविधियों से मुक्त किया जाना चाहिए । यह सबसे अच्छा केवल heterologously का उपयोग कर व्यक्त की, अपनत्व शुद्ध एंजाइमों द्वारा प्राप्त की है । दूसरा, ज्यादातर प्रयोगों के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सब्सट्रेट्स के एंजाइमी hydrolysis पूरा होने पर है । यह सुनिश्चित करेगा कि एक ही GH के साथ एक ही बायोमास hydrolyzed हर प्रयोग में एक ही फिंगरप्रिंट देता है । अंत में, वहां derivatization प्रतिक्रिया में fluorophore की एक अतिरिक्त होना चाहिए । यह सुनिश्चित करता है कि उपलब्ध कम करने समाप्त होता है पर लेबल १००% के करीब है । यह परिणाम की उच्च reproducibility, साथ ही मात्रात्मक है कि डेटा में परिणाम होगा ।
जेल और एजेंट गुणवत्ता प्रतिलिपि डेटा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । खराब गुणवत्ता बफ़र्स, विशेष रूप से गलत पीएच, जेल में हवा के बुलबुले, और नमक की एक अतिरिक्त के साथ नमूने सभी संकल्प और oligosaccharides के प्रतिधारण कारक को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल और परिणाम अनुभाग में वर्णित अनुशंसित नियंत्रणों को शामिल करने से समस्या निवारण सक्षम हो जाएगा ।
गति oligosaccharides की पहचान करने की क्षमता तक सीमित है । कुछ प्रयोगों के लिए, एक सरल फिंगरप्रिंट है कि सभी आवश्यक है । हालांकि, वास्तव में हवा के एक नमूने में glucomannan की मात्रा quantitate, उदाहरण के लिए, सभी जारी oligosaccharides की पहचान की आवश्यकता है, जो एक समय लेने वाली प्रक्रिया है । यह xylan3जैसे कम जटिल polysaccharides के लिए अधिक सरल है । के बाद से वहां कुछ oligosaccharide मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, यह हमेशा संभव नहीं हो सकता है या वांछनीय सभी बैंड की पहचान । इस मामले में, गति बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (यानी, मालदी-सीआईडी9 या ईएसआई-MS7, और एनएमआर6) के लिए बहुत मानार्थ डेटा प्रदान कर सकते हैं । इन विधियों के लिए, यह अक्सर एक बड़े पैमाने पर तैयारी करने के लिए उपयोगी है, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग है, और फिर दोनों गति से प्रत्येक अंश का विश्लेषण करने से पहले एमएस या एनएमआर । Whilst यह बताया गया है कि बैंड और उत्पाद की पहचान की जा सकती है मालदी-सीआईडी, व्यवहार में हमने पाया है कि इस सफलता की एक कम दर है (संभवतः acrylamide जेल के साथ लेबल oligosaccharides की बातचीत के कारण जब यूवी प्रकाश को उजागर) ।
गति के अंय प्रमुख सीमा प्रवाह है । उचित नियंत्रण के साथ अच्छी गुणवत्ता, व्याख्यात्मक जैल है, प्रत्येक जेल केवल ~ 10 प्रयोगात्मक नमूनों होगा, और एक शोधकर्ता प्रति दिन ~ 4 गति जैल चलाने के लिए उम्मीद कर सकते हैं । हाल ही में, केशिका ट्रो (CE) का उपयोग कर गति का एक संस्करण है, जो ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों की तैयारी की अनुमति देता है19विकसित किया गया है । यह सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है glycosyltransferase एंजाइम गतिविधियों और polysaccharide संरचनाओं की विशेषताएं6,19, हालांकि यह एक CE मशीन है, जो खरीद और बनाए रखने के लिए महंगा हो सकता है के लिए उपयोग की आवश्यकता है ।

जेल ट्रो द्वारा Polysaccharide विश्लेषण (गति) polysaccharides1,2,3के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए एक विधि है । संयंत्र सेल दीवार polysaccharides बेहद मुश्किल का विश्लेषण कर रहे हैं, और सबसे तरीकों महंगा उपकरण, कुशल ऑपरेटरों, और शुद्ध सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यहां, हम विस्तृत polysaccharide संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन, संरचनात्मक isomers के संकल्प सहित ।
संयंत्र सेल दीवार polysaccharide संरचना को समझना उन शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक है संयंत्र सेल दीवार के संश्लेषण या संयंत्र के विकास में संयंत्र सेल दीवार की भूमिका की खोज । हाल ही में, तथापि, संयंत्र सेल दीवार संरचना के कारण शोधकर्ताओं का एक व्यापक समूह के लिए दिलचस्प हो गया है संयंत्र बायोमास (अनिवार्य रूप से सेल की दीवार) का उपयोग कर एक टाक के रूप में जैव ईंधन और जैव रासायनिक उत्पादन करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए4। एक उदाहरण के रूप में, इस सामग्री के कुशल एंजाइमी शर्करीकरण polysaccharide संरचनाओं की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता है, ताकि अनुकूलित एंजाइमी कॉकटेल5का चयन किया जा सकता है ।
गति वैकल्पिक तरीकों जो यह जटिल glycan संरचनाओं के तेजी से विश्लेषण के लिए आदर्श बनाने पर कई फायदे हैं । सबसे पहले, यह प्रश्न में polysaccharide की शुद्धि की आवश्यकता नहीं है, के रूप में समाधान राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर)6के लिए आवश्यक है । दूसरे, गति संरचनात्मक isomers को हल कर सकते हैं, जन स्पेक्ट्रोमेट्री के विपरीत (MS, उदा., मैट्रिक्स की सहायता से लेजर desorption/ionization (मालदी) और electrospray ionization (ईएसआई)), जो भी तरल क्रोमैटोग्राफी (LC) द्वारा प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है 7. तीसरा, गति बहुत संवेदनशील है, कम picomole संकल्प के साथ, पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) या कागज क्रोमैटोग्राफी के विपरीत । अंत में, यह महंगी उपकरण या विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता नहीं है, के रूप में एमएस, एनएमआर, और नियंत्रण रेखा के लिए मामला है ।
गति विधि glycosyl hydrolase (GH) एंजाइमों, जो polysaccharides के एक मिश्रण में कुछ glycosidic संपर्क लक्ष्य की विशिष्टता पर निर्भर करता है । जब GH एंजाइम polysaccharide श्रृंखला पर कार्य करता है, यह एक को कम करने अंत जो तो रासायनिक derivatized हो सकता है पता चलता है, एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ इस मामले में. नमूना का unhydrolyzed भाग इसलिए इस विधि द्वारा undetectable रेंडर किया जाता है । लेबल oligosaccharides तो ट्रो द्वारा एक बड़े प्रारूप acrylamide जेल में अलग कर रहे हैं । यह बहुत ही अणुओं के उत्कृष्ट संकल्प देता है, उदाहरण के लिए, trisaccharides Glc-man-man और Glc-man-Glc एक अलग आरएफहोगा ।
गति बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है के लिए संयंत्र प्रजातियों में विभिंन xylan संरचनाओं8विशेषताएं, Arabidopsis6,9,10,11 में glycosyltransferase म्यूटेंट की पहचान के लिए , glycosyltransferase परख9प्रदर्शन करने के लिए, और उपंयास GH गतिविधियों12,13की विशेषता है । हम भी हाल ही में इस्तेमाल किया है यह खमीर सेल दीवार mannan (Mahboubi और मोर्टिमर, तैयारी में) की विशेषताएं । यहां हम निस्र्पक संयंत्र सेल दीवार glucomannan संरचना के लिए एक विधि का वर्णन, पिछले रिपोर्ट11,14के आधार पर ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligosaccaharide Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 3458-28-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannobiose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 14417-51-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotriose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 28173-52-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotetraose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 51327-76-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannopentaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-35-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannhexaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GLCML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other specialty chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td>
			<td>(Molecular probes) Thermo</td>
			<td>A350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-picoline borane</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting kit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660 kit</td>
			<td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling recirculating water bath&#160;</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>RCB20-plus 115v</td>
			<td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td>
			<td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Pack</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EC1000XL</td>
			<td>1000V&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SPD131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycosyl hydrolases</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging software ( Genesys)</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

संयंत्र सेल दीवार polysaccharides बेहद मुश्किल का विश्लेषण कर रहे हैं, और सबसे तरीकों महंगा उपकरण, कुशल ऑपरेटरों, और शुद्ध सामग्री की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यहां, हम विस्तृत polysaccharide संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन, संरचनात्मक isomers के संकल्प सहित । जेल ट्रो (गति) द्वारा polysaccharide विश्लेषण के लिए, संयंत्र सेल दीवार सामग्री ब्याज की hydrolases के लिए विशिष्ट glycosyl polysaccharide के साथ hydrolyzed है (जैसे, mannanases के mannan के लिए) । बड़े प्रारूप polyacrylamide जैल तो जारी oligosaccharides, जो फ्लोरोसेंट लेबल किया गया है अलग किया जाता है । जैल एक संशोधित जेल इमेजिंग प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ visualized किया जा सकता है । परिणामी oligosaccharide फ़िंगरप्रिंट या तो गुणात्मक की तुलना की जा सकती है या, प्रतिकृति के साथ, मात्रात्मक रूप से । अतिरिक्त glycosyl hydrolases (उदा., mannosidases और galactosidases) का उपयोग करके लिंकेज और बंटी जानकारी स्थापित की जा सकती है । Whilst इस प्रोटोकॉल glucomannan संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन, यह किसी भी polysaccharide के लिए लागू किया जा सकता है जो glycosyl hydrolases मौजूद विशेषता । वैकल्पिक रूप से, यह उपंयास glycosyl hydrolases परिभाषित polysaccharide सब्सट्रेट का उपयोग कर विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यहां, हम एक उदाहरण के गति जेल प्रोटोकॉल प्रति चलाने के विवरण के साथ डेटा व्याख्या और समस्या निवारण के साथ सहायता दिखाने के लिए, और यह सफल पेस जेल व्याख्या13,16के लिए एक सामांय गाइड के बाद है । सेल दीवार mannan सामग्री की एक मानक गति परख के एक प्रतिनिधि जेल चित्रा 2में दिखाया गया है, और लेन द्वारा लेन का वर्णन किया है ।
मानकों लेन 1, 2 और 3 व्यावसायिक रूप से खरीदा oligosaccharides (मैन1-मैन6) पर 5 (s), 10 (S2) और ५० (S3) pmol एकाग्रता की एक सीढ़ी दिखाओ । एक वाणिज्यिक oligosaccharide की एक नई बहुत प्राप्त करते हैं, यह एक जेल पर शुद्धता की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है. कई oligosaccharides, विशेष रूप से tetrasacccharides और अब, बहुलकीकरण (डीपीएस) के अंय डिग्री के oligosaccharides के साथ महत्वपूर्ण संदूषण हो सकता है, के रूप में आदमी के लिए यहां दिखाया गया है6 (* के साथ चिह्नित) । एक जेल quantitating करते समय, यह मानक वक्र की गणना के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह मानकों के न्यूनतम 3 सांद्रता है करने के लिए महत्वपूर्ण है । मानक वक्र की गणना भी derivatization प्रतिक्रिया पूरी होने पर अनिवार्य है कि यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोगी हो सकता है । ज्ञात सांद्रता के मानकों जैल के बीच तुलना की अनुमति है, और जुदाई की गुणवत्ता और derivatization गुणवत्ता के लिए एक उपयोगी नियंत्रण कर रहे हैं ।
सकारात्मक नियंत्रण लेन 4 konjac glucomannan के एक mannanase पाचन से पता चलता है । Konjac glucomannan व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और whilst यह है कि के रूप में एक ही संरचना नहीं है, उदाहरण के लिए, Arabidopsis में पाया, यह दो प्रयोजनों के कार्य करता है । सबसे पहले, यह एंजाइमी पाचन के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है । शोधकर्ता स्थापित करना चाहिए जो एक वाणिज्यिक सब्सट्रेट पसंद के अपने GHs के साथ पचा जब पूरा करने के लिए पचा (यानी, GH का एक विशाल अतिरिक्त प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जाता है) की तरह लग रहा है. यदि भविष्य के प्रयोगों में पैटर्न में परिवर्तन, यह या तो या तो GH शेयर की गतिविधि या संदूषण की हानि का संकेत कर सकते हैं । दूसरे, यह एंजाइम और बफर लवण की उपस्थिति में derivatization प्रतिक्रिया के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । यदि मानक अच्छे लग रहे हैं, लेकिन सकारात्मक नियंत्रण गरीब है, तो यह संकेत हो सकता है कि hydrolysis प्रतिक्रिया के एक घटक derivatization को निरोधात्मक है ।
जंगली प्रकार (WT) Arabidopsis स्टेम एयर + mannanase कॉकटेल (GH5 + GH26) 5 लेन एक WT Arabidopsis स्टेम की गति फिंगरप्रिंट दिखाता है (संदर्भ11,14) के साथ तुलना करें ।
csla9 Arabidopsis स्टेम एयर + mannanase कॉकटेल (GH5 + GH26) लेन 6 से पता चलता है एक Arabidopsis प्रमुख स्टेम mannan सिंथेस11कमी संयंत्र से स्टेम की गति फिंगरप्रिंट दिखाता है । WT और नकारात्मक नियंत्रण उंगलियों के निशान से तुलना करें । mannan के बहुमत Whilst इस संयंत्र में अनुपस्थित है, एक छोटी मात्रा रहता है, के रूप में सभी mannanase के लिए कम बैंड तीव्रता द्वारा सबूत-व्युत्पंन oligosaccharides यह अतिरिक्त mannan synthases (CSLA2, 3) द्वारा संश्लेषित है11।
नकारात्मक नियंत्रण-केवल एंजाइम लेन 8 जेल कि विशिष्ट है कि mannanase कॉकटेल में संदूषणों से प्राप्त नहीं कर रहे है पर बैंड से पता चलता है, और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए (* के साथ चिह्नित) ।
नकारात्मक नियंत्रण-WT हवा ही लेन 9 जेल है कि विशिष्ट नहीं है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए पर बैंड से पता चलता है (के साथ चिह्नित *) ।
नकारात्मक नियंत्रण- csla9 हवा ही लेन 10 जेल है कि विशिष्ट नहीं है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए पर बैंड से पता चलता है (के साथ चिह्नित *) ।
पाइन वुड एयर + mannanase कॉकटेल (GH5 + GH26) लेन 7 पाइन लकड़ी, जो galactoglucomannan शामिल की गति फिंगरप्रिंट से पता चलता है । यह स्पष्ट रूप से Arabidopsis को जारी oligosaccharides का एक अलग पैटर्न है, अपनी अलग संरचना के कारण ।
नकारात्मक नियंत्रण-चीड़ की हवा ही लेन 11 जेल है कि विशिष्ट नहीं है और विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए पर बैंड से पता चलता है (के साथ चिह्नित *) ।
एक गति जेल व्याख्या अपेक्षाकृत सरल है, लेकिन निंनलिखित बिंदुओं के बारे में जागरूकता की आवश्यकता है । मजबूत डेटा के लिए, यह गति से बाहर ले जाने के लिए सिफारिश की है कम 3 स्वतंत्र रूप से जैविक प्रतिकृति, और यह करने के लिए सिफारिश की है करने के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति पर कम से 2 तकनीकी प्रतिकृति । वर्णित नियंत्रण व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं, के रूप में गैर विशिष्ट बैंड के लिए बाहर रखा जाना चाहिए । हम भी दोहराने जैल पर एक अलग क्रम में नमूने लोड करने की सिफारिश, प्रभाव को बाहर करने के लिए जो transilluminator द्वारा असमान रोशनी से परिणाम. सटीक व्याख्या बैंड जो संतृप्त नहीं कर रहे है के विश्लेषण की आवश्यकता है । के बाद से कुछ oligosaccharide फिंगरप्रिंट दोनों बहुत उच्च और कम बहुतायत polysaccharides शामिल हो सकते हैं, हम एक ही जेल के कई जोखिम का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं । मानकों के लिए विभिंन छवियों के बीच सामांय इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कुछ प्रकार के प्रयोगों के लिए, हवा की तैयारी में polysaccharide की मात्रा का अंदाजा लगाने के लिए वांछनीय हो सकता है । Whilst यह एक गति जेल से यों तो संभव है, यह प्रत्येक GHs द्वारा जारी oligosaccharide और जहां यह गति जेल पर स्थित है की सटीक आणविक पहचान के ज्ञान की आवश्यकता है । यह वर्तमान में mannan के लिए पूरी तरह से ज्ञात नहीं है, लेकिन यह xylan3 उदा polysaccharides के लिए निर्धारित किया गया है । मानकों जैल के बीच सामान्य करने का एक तरीका प्रदान करते हैं, यहां तक कि जब quantitation नहीं किया जा रहा है, और इसलिए किसी भी गुणात्मक या अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण में सहायता करेगा.
व्यक्तिगत oligosaccharides की संरचना की पहचान GHs के कॉकटेल का उपयोग करके हासिल की जा सकती है । आगे GHs के अनुक्रमिक इसके अलावा जारी oligosaccharides के लिंकेज और प्रतिस्थापन के बारे में विवरण प्रकट कर सकते हैं (उदा., β-1, 4- ग्लुकोसिडेस है कि गैर पर कार्य करता है अंत को कम करने का पता चलता है जो मिश्रण में oligosaccharides कि सुविधा शामिल होगा) । उपलब्ध एंजाइमों galactosidases, glucuronidases और glucosidases (अतिरिक्त जानकारी के लिए CAZy डेटाबेस16 देखें) शामिल हैं; देखें हॉग, डी. एट अल. 17 एक उदाहरण के रूप में ।
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल के लिए अज्ञात GHs की गतिविधि विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, Arabidopsis स्टेम या konjac glucomannan के रूप में एक परिभाषित बायोमास, अज्ञात GHs13स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
चित्र 1 : यह चींटियों के साथ oligosaccharides के फ्लोरोसेंट derivatization के लिए योजना को दर्शाता है । Goubet2से संशोधित ।<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg "target =" blank "> इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
चित्र 2 : प्रतिनिधि पेस Arabidopsis से mannan फिंगरप्रिंट दिखा जेल, पाइन और एक Arabidopsis उत्परिवर्ती (csla9)) जो mannan के संश्लेषण बिगड़ा है । AlR एक mannanase कॉकटेल के साथ hydrolyzed था, और स्पर्म oligosaccharides एक derivatized से fluorophore थे । oligosaccharides जेल ट्रो द्वारा आकार, आकार, और चार्ज के आधार पर अलग किया गया । manno की एक सीढ़ी-oligosaccharides (Man1-6) जारी oligosaccharides के सापेक्ष मोबिल की पहचान करने में सहायता करने के लिए दिखाया गया है, और शुद्ध hydrolysis के एक mannan (konjac से व्युत्पंन) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है । * = गैर विशिष्ट बैंड । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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