Name: structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace
Uploaded: 2017-10-16T14:00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE at JoVE.com

ПАСЕ метод был разработан и оптимизированный различными членами группы Дюпре (Кембриджский университет, Великобритания) с годами, и мы ценим их вклад. Эта работа финансировалась в рамках Объединенного института Доу по биоэнергии (http://www.jbei.org) поддержке Департамента энергетики США, управление науки, Отделение биологических и экологических исследований, через контракт де-AC02-05CH11231 между Лоуренс Беркли национальной лаборатории и Департамента энергетики США. Мы также благодарим Thea подбора и Vy НПО за помощь в подготовке csla9 образцов.

<ol>
	<li>Barton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+fingerprinting+of+Arabidopsis+pectic+polysaccharides+using+polysaccharide+analysis+by+carbohydrate+gel+electrophoresis+(PACE).">Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE).</a> Planta. 224 (1), 163-174 (2006).</li><li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis:+A+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases.">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Anal Biochem. 300 (1), 53-68 (2002).</li><li>Mortimer, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Cell+Wall+Polysaccharides+Using+PACE.">Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE.</a> Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-568 (2008).</li><li>Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+glycosyl+hydrolases+and+biofuels:+a+natural+marriage.">Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage.</a> Curr Opin Plant Biol. 11 (3), 329-337 (2008).</li><li>Mortimer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+xylan+in+Arabidopsis+primary+cell+walls+is+synthesised+by+GUX3,+IRX9L,+IRX10L+and+IRX14.">An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14.</a> Plant J. 83 (3), 413-426 (2015).</li><li>Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligosaccharide+relative+quantitation+using+isotope+tagging+and+normal-phase+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (17), 2723-2730 (2008).</li><li>Busse-Wicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Xylan+Substitution+Patterns+in+Gymnosperms+and+Angiosperms:+Implications+for+Xylan+Interaction+with+Cellulose.">Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose.</a> Plant Physiol. 171 (4), 2418-2431 (2016).</li><li>Mortimer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+branches+from+xylan+in+Arabidopsis+gux+mutants+reveals+potential+for+simplification+of+lignocellulosic+biomass.">Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (40), 17409-17414 (2010).</li><li>Anders, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyl+transferases+in+family+61+mediate+arabinofuranosyl+transfer+onto+xylan+in+grasses.">Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 109 (3), 989-993 (2012).</li><li>Goubet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+glucomannan+in+Arabidopsis+is+synthesised+by+CSLA+glycosyltransferases,+and+influences+the+progression+of+embryogenesis.">Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis.</a> Plant J. 60 (3), 527-538 (2009).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+That+GH115+alpha-Glucuronidase+Activity,+Which+Is+Required+to+Degrade+Plant+Biomass,+Is+Dependent+on+Conformational+Flexibility.">Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility.</a> J Biol Chem. 289 (1), 53-64 (2014).</li><li>Rogowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+complexity+dictates+microbial+resource+allocation+in+the+large+intestine.">Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine.</a> Nat Commun. 6, 7481 (2015).</li><li>Handford, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localisation+and+characterisation+of+cell+wall+mannan+polysaccharides+in+Arabidopsis+thaliana.">Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana.</a> Planta. 218 (1), 27-36 (2003).</li><li>Boyes, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+stage-based+phenotypic+analysis+of+Arabidopsis:+a+model+for+high+throughput+functional+genomics+in+plants.">Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants.</a> Plant Cell. 13 (7), 1499-1510 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Carbohydrate Active Enzyme Database. , (2017).</li><li>Hogg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+architecture+of+Cellvibrio+japonicus+mannanases+in+glycoside+hydrolase+families+5+and+26+points+to+differences+in+their+role+in+mannan+degradation.">The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation.</a> Biochem J. 371, 1027-1043 (2003).</li><li>Brennan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+microbial+xylanases+from+insect+guts.">Unusual microbial xylanases from insect guts.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (6), 3609-3617 (2004).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+high+throughput+carbohydrate+profiling+technique+for+analyzing+plant+cell+wall+polysaccharides+and+carbohydrate+active+enzymes.">Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes.</a> Biotechnol Biofuels. 6, (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

ПАСЕ — это простой метод характеризующих полисахарид структуры. Он может быть применен к любой полисахарид, для которого известны СГС с характеризуется активностью, увидеть многочисленные примеры в литературе1,6,9,11. TT также был применен к характеристике Роман СГС12,13,18 и гликозидазы9, путем использования определенных полисахарид субстратов и акцепторов.
Воспроизводимость, интерпретируемых результатов зависит от трех ключевых шагов. Во-первых используемые СГС должны быть свободны от загрязняющих видов деятельности. Это лучше всего достигается только с помощью участием выраженной, сходства очищенные ферменты. Во-вторых для большинства экспериментов, важно что ферментативного гидролиза субстратов на завершение. Это будет гарантировать, что же биомассы, гидролизуется с же GH дает же отпечатков пальцев в каждом эксперименте. Наконец должно быть избыток Флюорофор в реакции деривации. Это гарантирует, что доступные сокращения концы обозначены на близка к 100%. Это приведет к высокой воспроизводимости результатов, а также количественные данные.
Гель и реагента качества имеют решающее значение для обеспечения воспроизводимости данных. Низкое качество буферов, особенно неправильной рН, воздушные пузыри в геле, и образцы с избытком соли можно все влияние резолюции и удержания фактор олигосахариды. Однако включение рекомендуемых элементов управления, описанных в разделе протокол и результаты позволят устранение неполадок.
ПАСЕ ограничивается ее способность идентификации олигосахаридов. Для некоторых экспериментов простой отпечатков пальцев-это все, что нужно. Однако, чтобы действительно quantitate количество глюкоманнан в пробе воздуха, например, личность всех выпущенных олигосахариды требуется, который является длительным процессом. Это гораздо проще для менее сложных полисахаридов например xylan3. Поскольку существует несколько стандартов олигосахарида коммерчески доступных, не всегда возможно возможным или желательным для выявления всех полос. В этом случае ПАСЕ может обеспечить очень лестно данных масс-спектрометрия (т.е., MALDI-CID9 или уни-MS7и ЯМР6). Для этих методов это часто полезно делать широкомасштабной подготовки, отделить, размер-гель-проникающей хроматографии и затем проанализировать каждую долю обоих темпами до MS или ЯМР. Хотя сообщалось, что полосы могут быть вырезан и выявленные MALDI-CID, на практике мы нашли, что это имеет низкий уровень успеха (возможно, из-за взаимодействия помечены олигосахаридов с гель акриламида при воздействии УФ света).
Другим основным ограничением ПАСЕ является пропускная способность. Иметь хорошее качество, интерпретируемых гели с соответствующие элементы управления, каждый гель будет только ~ 10 экспериментальных образцов, и исследователь может ожидать, чтобы запустить гели темп ~ 4 в день. Недавно версия ПАСЕ с помощью капиллярного электрофореза (CE) был развитых19, который позволяет подготовка проб в 96-луночных пластины. Она успешно использовался для характеристики гликозилтрансферазы ферментативной активности и полисахаридной структуры6,19, хотя она требует доступа к CE машина, которая может быть дорогим, чтобы приобрести и поддерживать.

Анализ полисахарид электрофорезом геля (ПАСЕ) — это метод для подробного описания полисахаридов1,2,3. Полисахариды клеточной стенки растений сложно анализировать, и большинство методов требуют дорогостоящего оборудования, квалифицированных операторов и больших объемов очищенного материала. Здесь мы опишем простой метод для получения подробной полисахарид структурную информацию, включая резолюцию структурных изомеров.
Структура полисахарид клеточной стенки завода понимание является необходимым для этих исследователей, изучение биосинтеза завод клеточной стенки или роль стены клетки растений в развитии растений. Недавно однако, завод клеточной стенки композиция стала интересным для более широкой группы исследователей из-за внимание на использовании биомассы растений (по существу клеточной стенки) в качестве сырья для производства биотоплива и биохимикаты4. Как, например эффективной ферментативные осахаривания этого материала требует, подробное понимание структур полисахарид, так что оптимизированный ферментативные коктейли могут быть выбранных5.
ПАСЕ имеет ряд преимуществ над альтернативных методов, которые делают его идеальным для быстрого анализа сложных glycan структур. Во-первых он не требует очистки полисахаридов, в вопросе, как это требуется для решения государства ядерного магнитного резонанса (ЯМР)6. Во-вторых, ПАСЕ может решить структурные изомеры, в отличие от масс-спектрометрия (МС, например, при содействии матрицы лазерная десорбция/ионизации (MALDI) и электроспрей ионизации (ESI)), который также может быть сложной задачей для выполнения жидкостной хроматографии (LC) 7. в-третьих, темпы очень чувствительна, с низким picomole резолюции, в отличие от тонкослойной хроматографии (ТСХ) или бумажной хроматографии. Наконец она не требует дорогостоящих оборудования или специалиста знания, как в случае для MS, ЯМР и LC.
ПАСЕ метод основывается на специфичности glycosyl гидролазы (GH) ферментов, которые нацелены на определенные гликосидные в смесь полисахаридов. Когда GH фермент действует на полисахаридные цепочки, она показывает уменьшение конец, который может затем быть химически дериватные, в этом случае с помощью флуоресцентные метки. Unhydrolyzed часть образца поэтому обрабатывается обнаружить этот метод. Приклеенные этикетку олигосахариды затем разделяются в гель акриламида большого формата электрофорезом. Это дает превосходное разрешение очень похожи молекул, например, Трисахариды Glc-человек-человек и Glc-человек-Glc будет иметь различные Rf.
ПАСЕ широко используется для характеристики различных xylan структур различных видов растений8, для выявления гликозилтрансферазы мутантов Arabidopsis6,9,10,11 , для выполнения анализов гликозилтрансферазы9и характеризовать Роман GH деятельности12,13. Мы также недавно использовали его для характеризуют Маннан клеточной стенки дрожжей (Mahboubi и Мортимер, в рамках подготовки). Здесь мы описываем метод характеризующих завод клеточной стенки глюкоманнан структура, на основе предыдущих докладов11,14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligosaccaharide Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS 3458-28-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannobiose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 14417-51-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotriose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 28173-52-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannotetraose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 51327-76-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannopentaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-35-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannhexaose</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>CAS: 70281-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GLCML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other specialty chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td>
			<td>(Molecular probes) Thermo</td>
			<td>A350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-picoline borane</td>
			<td>TCI</td>
			<td>B3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specialty Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel casting kit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660 kit</td>
			<td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling recirculating water bath&#160;</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>RCB20-plus 115v</td>
			<td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td>
			<td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Pack</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>EC1000XL</td>
			<td>1000V&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SPD131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycosyl hydrolases</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging software ( Genesys)</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

Полисахариды клеточной стенки растений сложно анализировать, и большинство методов требуют дорогостоящего оборудования, квалифицированных операторов и больших объемов очищенного материала. Здесь мы опишем простой метод для получения подробной полисахарид структурную информацию, включая резолюцию структурных изомеров. Для анализа полисахаридный гель-электрофорез (ПАСЕ) завод клеточной стенки Материал гидролизуется с glycosyl гидролаз, специфичные для полисахарид интерес (например, mannanases для Маннан). Большой формат полиакриламидных гелей затем используются для разделения выпустила олигосахариды, которые были дневно помечены. Гели могут быть визуализированы с модифицированных гель системы (см. Таблицу материалы). Результате олигосахарида отпечатков можно либо сравнить качественно или с репликацией, количественно. Связь и ветвления информации могут создаваться с помощью дополнительных glycosyl гидролазы (например, mannosidases и galactosidases). Хотя этот протокол описывает метод для анализа структуры глюкоманнан, он может применяться к любой полисахарид, для которого характерны glycosyl гидролазы существуют. Кроме того она может использоваться для характеристики Роман glycosyl гидролаз, используя определенные полисахариды субстратов.

Здесь мы покажем пример ПАСЕ гель в протокол, а также описания для оказания помощи в интерпретации данных и устранения неполадок, и это сопровождается общее руководство для успешных ПАСЕ гель интерпретации13,16. Представитель гель стандартной ПАСЕ пробирного клеточной стенки Маннан содержание показано на рисунке 2и описано Лейн, пер.
Стандарты Дорожки 1, 2 и 3 показывают лестница коммерчески приобретенных олигосахариды (человек1-6человек) на 5 (S1), 10 (S2) и 50 концентрации пмоль (S3). При получении новой много коммерческих олигосахариды, важно проверить чистоту на геле. Многие олигосахариды, особенно tetrasacccharides и дольше, могут иметь значительные загрязнения с олигосахариды других степеней полимеризации (DPs), как показано ниже для6 человек (отмеченные *). При quantitating гель, важно иметь по крайней мере 3 концентрации стандартов, так как он необходим для расчета калибровочной кривой. Расчет стандартной кривой также может быть полезно для обеспечения того, чтобы деривации реакцию по существу на завершение. Стандарты известных концентрациях позволяют сравнивать гели и являются полезным управления для деривации качественных и разделения.
Положительный контроль Переулок 4 показывает mannanase пищеварение Конжак глюкоманнан. Конжак глюкоманнан доступен коммерчески, и хотя он не имеет ту же структуру, что и, например, в проростках Arabidopsis, он служит двум целям. Во-первых это важный элемент для ферментативного пищеварения. Исследователь следует установить, что коммерческие субстрата, переваривается с их СГС выбора выглядит как когда усваивается до завершения (то есть, когда подавляющее избыток GH добавляется к реакции). Если в будущем эксперименты шаблон изменения, это может указывать либо потеря активности или загрязнение запасов GH. Во-вторых она служит элемент управления для деривации реакции в присутствии солей фермента и буфера. Если стандарты выглядеть хорошо, но положительный контроль бедных, то это может означать, что компонент реакции гидролиза ингибирующее для деривации.
Арабидопсис дикого типа (WT) штока воздуха + mannanase коктейль (GH5 + GH26) Лэйн 5 показывает темпы отпечатков пальцев WT Arabidopsis стебля (Сравните с ссылки11,14).
csla9 Арабидопсис штока воздуха + mannanase коктейль (GH5 + GH26) Переулок 6 показывает, что показывает темпы отпечатков пальцев проистекают из Arabidopsis растений не хватает основных штока Маннан синтазы11. Сравните с WT и отрицательного контроля отпечатков пальцев. Хотя большинство Маннан отсутствует в этом растении, остается небольшое количество, о чем свидетельствует уменьшение полосы света для всех mannanase производные олигосахариды, это синтезируется дополнительных Маннан synthases (CSLA2, 3)11.
Отрицательный контроль - фермента только Лэйн 8 показывает полос на геле, не конкретные, которые являются производными от загрязняющих веществ в mannanase коктейль и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Отрицательный контроль - WT воздуха только Лейн 9 показывает полос на гель, который не являются конкретными и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Отрицательный контроль- csla9 Только для AIR Лейн 10 показывает полос на гель, который не являются конкретными и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Сосновая древесина воздуха + mannanase коктейль (GH5 + GH26) Переулок 7 показывает темпы отпечатков пальцев из соснового дерева, которое содержит galactoglucomannan. Это явно имеет другой шаблон выпустила олигосахариды в проростках Arabidopsis, из-за его различные структуры.
Отрицательный контроль - хвойный воздух только Лэйн 11 показывает полос на гель, который не являются конкретными и должны быть исключены из анализа (отмеченные *).
Интерпретация гель ПАСЕ относительно проста, но требует осведомленности о следующие моменты. Для надежных данных рекомендуется выполнять реплицирует ПАСЕ на по крайней мере 3 самостоятельно выращенные биологическим, и рекомендуется выполнять по крайней мере 2 технических реплицирует на каждом биологических реплицировать. Описанные элементы управления имеют решающее значение для толкования, как неспецифичных должны быть исключены. Мы также рекомендуем загрузки образцов в другом порядке на репликацию гели, чтобы исключить последствия, являющиеся результатом неравномерного освещения transilluminator. Точная интерпретация требует анализа групп, которые не насыщен. Поскольку некоторые олигосахарида отпечатки пальцев могут содержать оба очень высокие и низкие изобилии полисахаридов, мы рекомендуем, анализируя несколько экспозиций же геля. Стандарты могут использоваться для нормализации между различными изображениями.
Для некоторых типов экспериментов может быть желательно, чтобы подсчитать количество полисахаридов в подготовке воздуха. Хотя это можно подсчитать из ПАСЕ гель, это требует знания точные молекулярные личность каждого олигосахариды, выпущенная СГС и где он расположен на темпы гель. Это в настоящее время не известно полностью для Маннан, но было определено для других полисахаридов например xylan3. Стандарты обеспечивают способ нормализации между гели, даже когда количественный не выполняется и поэтому будет оказывать помощь в любом качественного и полуколичественного анализа.
Выявление структуры отдельных олигосахариды может быть достигнуто с помощью коктейли из СГС. последовательная добавлением дальнейших СГС может раскрыть сведения о связи и замены выпустила олигосахариды (например, Добавление β - 1,4 - глюкозидазы, который действует на конце-уменьшение покажет какие олигосахариды в смеси содержат эту функцию). Доступные ферменты включают galactosidases, glucuronidases и глюкозидазы (см. в CAZy базы данных16 для получения дополнительной информации); увидеть Хогг, D. et al. 17 в качестве примера.
Выше протокол может использоваться для характеризовать деятельность неизвестных СГС. В этом случае определенные биомассы, например стволовых или Конжак глюкоманнан Arabidopsis, должны использоваться для экран неизвестного СГС13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Рисунок 1 : Это показывает схему для флуоресцентных деривации олигосахаридов с МУРАВЬЯМИ. Изменение от Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg» целевых = «_blank» > пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Рисунок 2 : Гель представитель ПАСЕ Показываю Маннан отпечатков пальцев от Arabidopsis, сосна и мутантов Arabidopsis (csla9) ограничивает биосинтез Маннан. AlR был гидролизуется с mannanase коктейль, и выпущенные олигосахариды были дериватные с Флюорофор. Олигосахариды были отделены электрофорезом геля на основе размер, форму и заряд. Лестница Манно олигосахариды (Man1-6) показано для оказания помощи в определении относительной подвижности выпустила олигосахариды, и гидролиза очищенный Маннан (производный от Аморфофаллус коньяк) отображается как позитивный элемент управления. * = неспецифичных. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE at JoVE.com

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Протокол для структурного анализа полисахаридов электрофорезом геля (ПАСЕ), используя в качестве примера, маннан описан.

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Подготовка образцов опорных пленок в просвечивающей электронной микроскопии с использованием опорного флотационного блока

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...