Name: stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af en bevilling fra ministeriet for økonomi og konkurrenceevne (MINECO) af Spaniens regering, SAF2016-78898-C2-2-R.

denne undersøgelse blev gennemført i nøje overensstemmelse med både spanske forordninger (kongelig dekret 53/2013 - loven 32/2007) og EU 's retningslinjer (direktiv 2010/63/EU) pleje og anvendelse af dyr inden for biomedicinsk forskning.
 1. Forberedelse af rotte Bemærk: vi udført eksperimenter i mandlige rotter at undgå hormonelle ændringer.
<ol><li>Anesthetize dyret ved hjælp af en blanding af ketamin hydrochlorid (30 mg/kg) og xylazinhydrochlorid (5 mg/kg) injiceres intramuskulært; med denne dosis, rotten skal være dybt bedøvede for omkring 1 h.</li>
	<li>Klemme rotten &#39; s tå; fravær af en tilbagetrækning refleks angiver, at dyret er helt bevidstløs. Hvis rotten reagerer på knibe, give supplerende anæstesi på en tredjedel af den oprindelige dosis.</li>
	<li>Barbere hovedbunden og desinficere det kirurgiske område med povidon-jod.</li>
	<li>Placere dyret på en varmepude til at opretholde en temperatur på 38 ° C og stabilisere dyret &#39; s chef i et stereotaxisk rammen ved hjælp af to øre barer og en bid bar. Forsigtig undgå piercing trommehinden med øre barer.</li>
	<li>Beskytte øjnene ved at anvende en dråbe oftalmologiske gel eller serum saltvand til hvert øje.</li>
</ol> 2. Placering af AC i den tidsmæssige knoglen af rotten <ol><li>ved hjælp af en skalpel, gøre et snit langs midterlinjen at eksponere kraniet og trække periosteum dække overfladen af kraniet.</li>
	<li>Bruger en steril bomuld spidsen forsigtigt fjerne enhver blod dækker overfladen af kraniet til at visualisere bregma, lambda og interaural 0 ifølge Paxinos og Watson atlas af rotte hjernen 22.</li>
	<li>Gøre et snit i den tidsmæssige muskel nær sin dorsale indsættelse på kraniet med en skalpel. Træk muskel ud ved hjælp af en nål og sutur materiale, og løse suture klæde at den stereotactic ramme; Dette vil udsætte den tidsmæssige knoglen. Hvis der opstår blødning, skylles med koldt sterilt saltvand.</li>
	<li>Placerer en steril lige nål i den stereotactic micromanipulator, og sørg for, at det er fuldt ud sikret.</li>
	<li>Langsomt sænke nålen, indtil det er højre over overfladen af kraniet, således at spidsen af nålen er sat til interaural 0. Sæt dette punkt nul, og bestemme koordinaterne fra dette punkt.</li>
	<li>Hjernen område af interesse, variere stereotactic koordinater. Bestemme disse koordinater ved at udnytte Paxinos og Watson atlasset af rotte hjernen 22. Når koordinaterne bestemmes, flytte nålen til at matche disse koordinater.</li>
	<li>Target AC ved hjælp af koordinaterne for de følgende fire punkter: A: A / P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-8,67 mm. lavere nål til lige over den tidsmæssige knoglen at visualisere hvert af disse fire punkter. Brug en tusch, markere punkter på den tidsmæssige knoglen og forbinde dem for at tegne et rektangel; rektanglet vil tjene som en guide til at åbne i et vindue i knoglen ( figur 1).</li>
</ol> 3. Kirurgiske eksponering af AC <ol><li>åbne vinduet ved hjælp af en elektrisk boremaskine og en lille drill bit (0,6 mm Ø). Bore omkredsen af rektangel på 8.000 omdr. / min., indtil knoglen giver væk. Cool boringen overfladen skylles med koldt sterilt saltvand til at forhindre skader på subkortikale strukturer. Når knoglen ekser, kan et fald i modstand påvises. Pas på at ikke bore hjernen.</li>
	<li>Når grænserne er løs, træk op dækker knoglen med fine pincet og gemme det i kolde sterilt saltvand.</li>
</ol> 4. Ablation af AC <ol><li>ved hjælp af en kirurgisk mikroskop (10 X), forsigtigt skære meninges med en microsurgical kniv og fjerne dem ved hjælp af to fine spids pincet. Hvis der opstår blødning, skylles med koldt sterilt saltvand.</li>
	<li>Forsigtigt Aspirér AC ved hjælp af en kirurgisk sugeanordning (pres-0.24 bar) koblet til en steril 20 G stump spids nål. Dette punkt er kritiske og skal udføres meget omhyggeligt: Aspirér kun de seks kortikale lag og ikke den underliggende hvide substans.</li>
	<li>Opsug indtil perforering arterierne standser blødning.</li>
	<li>Når aspiration er færdig, dække det skadede område med den udpakkede knogle og anvende en resorberbare hæmostatisk gaze.</li>
	<li>Lad de tidsmæssige muskel genvinde sin oprindelige position, og derefter sutur i huden ved hjælp af sår clips (9 mm). Anvende antibiotisk salve (Se Tabel af materialer). Fortsætte med at anvende salve på såret to gange dagligt i tre dage. 
	Bemærk: Hver ansøgning består af et tyndt lag på sår.</li>
	<li>Injicere buprenorphin subkutant i rotte (0,05 mg/kg) som en smertestillende 1 efter operationen, og derefter hvert 8 h under 72 h.</li>
	<li>Holde dyret på den hede afrivningsblok, indtil det vågner op, og sende det tilbage til sin bolig bur at inddrive.</li>
	<li>Hus dyr individuelt at forhindre bur kammerater fra at røre ved området syet, og give nogle berigelse elementer. Ændre savsmuld dagligt for at forhindre infektion, og nøje kontrollere, at dyret genopretter korrekt og viser ikke nogen tegn på ubehag.</li>
</ol> 5. Væv indsamling Advarsel: når du håndterer PARAFORMALDEHYD (PFA), både fast og vandig, bære personlige værnemidler (PPE) og bruge en sikkerhed fryser.
 Bemærk: forberede 750 mL formaldehyd løsning ved at opløse 4% (w/v) PFA i 1 x fosfatbufferet løsning (PBS) ved hjælp af varme (55 ° C). Filtrer formaldehyd løsning med filtrerpapir. Forberede Ringer &#39; s løsning ved at opløse 8,5 g NaCl, 0,25 g af KCl og 0,2 g NaHCO 3 i 1000 mL vand (løsning pH = 6.9).
<ol><li>Lad dyret overleve så længe det er nødvendigt for undersøgelsen. Når forskning udført med AC ablated rotte er afsluttet, uhelbredeligt anaesthetize det ved intra peritoneal injektion af 0,1 mL af natrium pentobarbital (60 mg/kg). Vurdere dybde af anæstesi af tå knivspids og fraværet af tilbagetrækning refleks.</li>
	<li>Når dyret er dybt bedøvede, udføre en intracardiac perfusion 23 125 ml Ringer &#39; s løsning efterfulgt af 750 mL af formaldehyd løsning ved hjælp af en nål sporvidde på 1,8 mm i indvendig diameter.</li>
	<li>Når perfusion er færdig, halshugge rotte på den første halshvirvel.</li>
	<li>Bruger saks til at fjerne hud og muskel fra hovedet og udsætte kraniet. Brug saks til at klippe og åbne foramen magnum og fjerne bagsiden af kraniet.</li>
	<li>Gøre en transversal skåret i orbital knoglen ved hjælp af Spencer saks, og brug rongeurs til at skære langs de øverste kant af kraniet til at eksponere hjernen. Pas på ikke at skade hjernen.</li>
	<li>Når hjernen er udsat, forsigtigt fjerne dura mater ved hjælp af fine spids pincet. Bruge en finger til at forsigtigt scoop under og ophøje hjernen. Hæve hjernen og skære nerver untIl det er gratis. Fordyb hjernen i formaldehyd løsning og opbevares ved 4 ° C i 24 h.</li>
</ol> 6. Lokalisering af AC læsioner <ol><li>efter efter fiksering, omhyggeligt placere hjernen i en sagittal rotte hjernen matrix udsætter den laterale overflade af hjernen.</li>
	<li>Placer et kamera 21 cm ovenstående cortex overfladen ved hjælp af et kamera indehaveren, skal du vælge den &#34; super makrofotografering &#34; mode, og tage et billede af hjernen overflade.</li>
	<li>Læg hjernen i en koronale rotte hjernen matrix udsætter den dorsale overfladen af hjernen, og tage et andet billede.</li>
	<li>Bruger et billedredigeringsprogram, åbne billederne og Nedskaler 50% at gøre det lettere at arbejde med dem. Identificere bregma, lambda og interaural 0 referencer på billedet ifølge Paxinos og Watson koordinater 19, og markere deres position i billeder ( figur 2). Tegne konturerne af ablation over den laterale billede af hjernen. Beregn omkredsen.</li>
	<li>Import koordinaten kort, hvor den primære (A1) og sekundære regioner (dorsale og ventrale cortex) AC er placeret 18 til filen i programmet editor hvor du arbejder med billeder. Klik på kortet og trække det for at indsætte det til den laterale fotografi af ablated hjernen.
	<ol><li>Gør bregma og lambda referencer for at koordinere kort falder sammen med bregma og lambda referencerne identificeret i billedet af den laterale hjernen.</li>
		<li>Brug den rhinal revne som reference til at justere billedet af hjernen til kortet, og gøre dem falde sammen ( figur 2B).</li>
	</ol></li> <li>Beregn procentdel af læsion i forhold til området besat af AC.</li></ol>

<ol>
	<li>Talwar, S. K., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+frequency+discrimination+in+the+white+rat.">Auditory frequency discrimination in the white rat.</a> Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).</li><li>Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogram+of+the+hooded+Norway+rat.">Audiogram of the hooded Norway rat.</a> Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).</li><li>Malmierca, M. S., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+System.">Auditory System.</a> The Rat Nervous System. , 995-1080 (2004).</li><li>Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Auditory+Efferent+System:+New+Insights+from+Cortex+to+Cochlea.">Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea.</a> Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).</li><li>Dinse, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+Case+for+Enrichment.+Focus+on+"Environmental+Enrichment+Improves+Response+Strength,+Threshold,+Selectivity,+and+Latency+of+auditory+cortex+Neurons.".">Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.".</a> J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).</li><li>Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+learning+shapes+the+neural+code+for+stimulus+magnitude+in+primary+auditory+cortex.">Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+Pathways+Determine+Breadth+of+Subthreshold+Frequency+Receptive+Fields+in+Primary+auditory+cortex.">Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex.</a> J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).</li><li>Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mammalian+auditory+cortex+in+the+perception+of+elementary+sound+properties.">Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties.</a> J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).</li><li>Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+synaptic+inhibition+can+create+intensity-tuned+auditory+cortex+neurons.">Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons.</a> Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).</li><li>Le&#243;n, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamam&#233;, C. M., Delano, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortex+basal+activity+modulates+cochlear+responses+in+chinchillas.">Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas.</a> PLOS ONE. 7 (4), e36203 (2012).</li><li>Jager, K., Kossl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticofugal+Modulation+of+DPOAEs+in+Gerbils.">Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils.</a> Hear Res. 332, 61-72 (2016).</li><li>Dragicevic, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Olivocochlear+Reflex+Strength+and+Cochlear+Sensitivity+are+Independently+Modulated+by+auditory+cortex+Microstimulation.">The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).</li><li>Clarkson, C., Herrero-Turri&#243;n, M. J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Auditory+Deafferentation+Induces+Long-Term+Plasticity+in+the+Inferior+Colliculus+of+Adult+Rats:+Microarray+and+qPCR+Analysis.">Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis.</a> Front Neural Circuits. 6, 86 (2012).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#769;an, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regulation+in+calretinin+staining+in+the+rat+inferior+colliculus+after+unilateral+auditory+cortical+ablation.">Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation.</a> J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+down-regulation+of+sound-induced+c-Fos+protein+expression+in+the+inferior+colliculus+after+ablation+of+the+auditory+cortex.">Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex.</a> Front Neuroanat. 4, 141 (2010).</li><li>Hunter, K. P., Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bilateral+lesions+of+auditory+cortex+in+mice+on+the+acoustic+startle+response.">Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response.</a> Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).</li><li>Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+input+and+efferent+activity+regulate+the+expression+of+molecules+involved+in+cochlear+micromechanics.">Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics.</a> Front Syst Neurosci. 8, 253 (2014).</li><li>Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+of+brainstem+electrical+evoked+responses+to+sound+after+restricted+ablation+of+the+auditory+cortex.">Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex.</a> PLOS ONE. 8 (9), e73585 (2013).</li><li>Lamas, V., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+auditory+cortex+results+in+changes+in+the+expression+of+neurotransmission-related+mRNAs+in+the+cochlea.">Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea.</a> Hear Res. 346, 71-80 (2017).</li><li>Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+tonotopic+core+of+rat+auditory+cortex:+physiological+evidence+for+a+posterior+field.">Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field.</a> J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).</li><li>Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+auditory+receptive+field+organization+across+five+cortical+fields+in+the+albino+rat.">Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat.</a> J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2005).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564 (2012).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at forskningen blev gennemført i mangel af nogen kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

En vellykket hjerneoperation afhænger af to faktorer: at holde dyrene i live under og efter proceduren, og præcist at lokalisere område af interesse. At sikre at rotten er dybt bedøvede under operationen (test tilbagetrækning refleks), og modtager passende analgetika og ikke-ototoksiske antibiotika bør hjælpe overlevelse. Derudover holdes rotter på en varmepude, indtil det vågner fra anæstesi til at undgå hypotermi. Suturering vil falde modtagelighed for infektion, og korrekt teknik er af afgørende betydning: dyr vil samle på deres sår clips, så de skal implanteres stramt nok til at forhindre fjernelse uden at lægge for meget spænding på såret.
Til præcist lokalisere AC (eller enhver anden kortikale område), er det vigtigt at fastlægge placeringen af bregma, lambda og interaural 0 til at bruge dem som referencer til beregning af grænserne for det målrettede område. Eventuelle fejl i beregning af koordinater vil resultere i den delvis ablation af AC eller den uønskede aspiration af andre omkringliggende områder. Således bør nål tip kun røre knoglen på interaural 0, og derefter oversætte antero-posterior og medio-lateral koordinaterne efter hvad der er beskrevet i denne protokol.
I dette håndskrift, har vi også beskrevet hvordan man kirurgisk udsætte og ablate AC. Der er tre vigtige trin: boring-processen, åbning og fjernelse af meninges og ablation af aspiration. Boring bør udføres ved en lav hastighed med minimum pres, som en boring højhastigheds genererer varme, der kan påvirke i nærheden subkortikale strukturer. Dog skal fastholde en lav hastighed og køling boring området med kolde sterilt saltvand forebygge skader. Derudover er minimum pres nødvendigt at undgå en pludselig pause i kraniet og efterfølgende skade den underliggende cortex. Åbning og fjernelse af meninges, der dækker AC skal udføres omhyggeligt for at undgå at bryde blodkarrene. Hvis der opstår blødning, tidligt og sent prognosen er generelt ugunstig, og det er tvivlsomt om sådan et dyr opfylder inklusionskriterierne for en pålidelig undersøgelse. Vi anbefaler eutanasi i dette tilfælde. Endelig skal aspiration (sandsynligvis det vanskeligste aspekt i at udføre en effektiv læsion), være begrænset til det grå materie. Der er to indikatorer, der kan hjælpe med at registrere tilstedeværelsen af den hvide substans: (1) en ændring i farvekontrast, som den hvide substans er lysere end den grå materie; og (2) ophør af blødning fra perforering arterierne.
Efter enhver manipulation udført i hjernen, er det nødvendigt at vurdere lokalisering, størrelse og udvidelse af proceduren i cortex til efterfølgende analyse og validering af data indhentet fra dyret. I dette manuskript detalje vi hvor hen til lokalisere den ablation udført i cortex ved hjælp af en koordinere kort tidligere beskrevet af vores gruppe18. Dette kort blev bygget ved hjælp af anatomiske referencer fra seriel afsnit rekonstruktioner af histologiske sektioner, korreleret med Paxinos og Watson atlas af rotte hjernen22. I overensstemmelse hermed, kortet skelner mellem den primære (A1) og sekundære cortex (dorsale og ventrale) af AC. Den største fordel ved denne koordinere kort er, at det giver mulighed for hurtig lokalisering af læsion ved at sammenføje et billede taget fra den laterale overflade af hjernen placeret i en sagittal hjernen matrix. En anden fordel er, at laboratorier med mindre erfaring i anatomi kan bruge kortet ved at tilpasse det til deres dyremodeller. Det er kun nødvendigt at angive afstande mellem bregma, lambda og interaural 0 referencer i en kontrol perfunderet hjerne og skalere kortet op eller ned i overensstemmelse hermed. Brug den Rhinal revne som reference til at justere billedet af hjernen til kortet. Dybden af ablation kan ikke bestemmes i denne koordinere kort, så det bør fastsættes i hjernen histologiske sektioner.
Kombinationen af stereotactic metoder med den kirurgiske eksponering af AC er grundlæggende metoder, som nemt kunne tilpasses af enhver efterforsker, der ønsker at målrette AC i rotter. Dette kan være en akut eksperiment eller én, der kræver implantation af faste enheder. Desuden, den kirurgisk ablation af AC har tidligere er blevet anvendt som model til at studere virkningerne af kronisk kortikale afsavn i høring. AC ablations kunne også bruges til at studere de effekter, som ensidige AC ablations udøve i andre kortikale områder, eller tjene som model for slagtilfælde. De eksperimentelle design beskrevet her er derfor nyttige metoder, der kan anvendes enkeltvis eller i kombination til en bred vifte af eksperimentelle design.

Rotten er en af de mest almindeligt anvendte animalske modeller i auditive neurovidenskab. Robusthed ved dets opførsel, gør det i stand til at arbejde for hundredvis af forsøg pr. dag. Dens følsomhed og spektral acuity for høring1,2, og den anatomiske og funktionelle tilrettelæggelse af dets centrale system, sammenlignes med andre pattedyr3, gør rotten en passende dyremodel til at analysere en bred vifte af forskningsemner i auditive neurovidenskab. Rotte auditive cortex (AC), navnlig har været genstand for flere anatomiske og fysiologiske undersøgelser, der har prøvet at forstå dens struktur, organisation og rolle i lydbehandling3. I dag har blevet AC populære blandt neuroforskere interesseret i erfaring-afhængighed plasticitet, auditiv perception, synaptic grundlaget for modtagelige felt organisation og kortikale kontrol af lydbehandling i den subkortikale auditive kerner4,5,6,7,8,9. For at løse de udfordringer, som disse nye tilgange udgør, vil procedurer, der kan præcist lokalisere og kirurgisk udsætte AC fremskynde forskningsindsats. Stereotactic teknikker gør det nemt at lokalisere bestemte områder i hjernen uden fysiologi testning. Selv om hjernen størrelse varierer lidt mellem dyr, kan placeringen af enhver hjerne område bestemmes ved hjælp af stereotactic koordinater angivet fra vartegn på kraniet af rotte hjernen.
Den begrænsede ablation af AC er kirurgisk fjernelse af regionen sensoriske cortex mest direkte forbindelse med hørelse. I modsætning til andre metoder, der anvendes til at blokere aktiviteten af AC, såsom køling eller lokale lidocain injektioner10,11,12, den kirurgisk ablation af AC resulterer i kronisk tab af funktion. Således, AC ablations er mere velegnede til at studere de langsigtede virkninger af kortikale afsavn, samt de efterfølgende fænomener af læsion plasticitet. Kombinationen af stereotactic metoder med kirurgisk ablations af AC har været anvendt med succes til at studere de fysiologiske, adfærdsmæssige og molekylær effekter af kortikale kontrol afsavn13,14,15 ,16,17,18,19. For eksempel, er en rotte model med bilaterale AC ablations blevet brugt til at studere virkningerne af kortikale ablation i auditive overraske refleks og auditive hjernestammen svar (ABR)16. For nylig har vi sammenlignet de virkninger det ensidige kontra bilaterale ablations af rotte AC producere i ABR tærskler, amplituder og ventetid på forskellige tidspunkter efter skade18. Derudover er rotte model af restriktive AC ablation også blevet brugt til at studere effekten af corticofugal pathway degeneration i ringere collicus13,14,15 og indre øre17 ,19. Efter sådan en manipulation er udført i hjernen, er det nødvendigt at vurdere lokalisering, størrelse og udvidelse af læsioner i cortex. Selvom meget nyttigt, er den største begrænsning af tonotopic kort baseret på neuronal svar20,21 de elektrofysiologiske teknikker, der kræves for at lokalisere de auditive felter i rotte hjernen. Da ikke alle laboratorier har det nødvendige udstyr og/eller ekspertise til at foretage sådanne optagelser, konstrueret vi en koordinere kort baseret på overførsel af cytoarchitectural grænserne for AC til et billede af hjernens overflade18. Dette kort kan være meget nyttigt at finde AC uden fysiologi testning.
Denne protokol beskriver en metode til stereotactically guidede placering, kirurgiske eksponering og ablation af AC i rotter. Det beskriver også, hvordan du bruger vores koordinere kort18 til nemt lokalisere en udvidelse af læsion over et billede af overfladen af ablated hjerner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Ins.</td>
			<td>900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>WILD M650 Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>DAGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor</td>
			<td>W&#38;H elco</td>
			<td>5118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond burr</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>GD021R</td>
			<td>0.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suction device</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>Atmoforte E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td></td>
			<td>30 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Meda</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline serum</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G sterile needle</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>10.331.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Indivior UK</td>
			<td>Buprex</td>
			<td>0.01-0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.120.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spencer scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.804.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical knife</td>
			<td>MSP</td>
			<td>7503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostatic gauze</td>
			<td>Surgicel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saggital rat Brain Matrix</td>
			<td>Activational systems Inc.</td>
			<td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus 5.1 MP</td>
			<td>C-5060 wide zoom</td>
			<td>lens F2.8-4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Reflex 9</td>
			<td></td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canvas 12</td>
			<td>ACD Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 1.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separatory funnel</td>
			<td>labbox</td>
			<td>11409</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

Rotte auditive cortex (AC) er ved at blive populær blandt auditive neurovidenskab efterforskere, der er interesseret i erfaring-afhængighed plasticitet, auditive perceptuelle processer og kortikale kontrol af sound processing i subkortikale auditive kerner. For at imødegå nye udfordringer, en procedure til præcist lokalisere og kirurgisk eksponere de auditive cortex vil fremskynde denne forskningsindsats. Stereotactic Neurokirurgi bruges rutinemæssigt i præ-klinisk forskning i dyremodeller til at indpode en nål eller elektrode på en pre-definerede placering i den auditive cortex. I den følgende protokol bruger vi stereotactic metoder i en ny måde. Vi identificerer fire koordinere point over overfladen af temporal bone af rotte at definere et vindue, der når åbnet, præcist udsætter både primære (A1) og sekundære (dorsale og ventrale) cortex af AC. bruger denne metode, vi derefter udføre en kirurgisk ablation af AC. Efter sådan en manipulation er udført, er det nødvendigt at vurdere lokalisering, størrelse og udvidelse af læsioner i cortex. Dermed, vi også beskrive en metode for at nemt finde AC ablation postmortem ved hjælp af en koordinere kort fremstillet ved at overføre cytoarchitectural grænserne for AC til overfladen af hjernen. Kombinationen af stereotactically guidede placering og ablation af AC med lokalisering af det skadede område i et koordinere kort postmortem letter valideringen af oplysninger fra dyret, og fører til en bedre analyse og forståelse af data.

Vi udførte en stereotactically guidede placering, kirurgiske eksponering og ensidige ablation af AC i tre Wistar rotter. Lokalisering af læsion bekræftet, at ablations udført i tre rotter trængte de store underinddelinger af AC (primær, dorsal og ventral cortex), og omfattede en række 80 til 100% af det samlede AC-området (figur 2B).
Protokollen beskrevet her til at udføre restriktive AC ablations har tidligere været anvendt i vores laboratorium til at studere de langsigtede virkninger af kortikale kontrol afsavn i subkortikale auditive kerner, samt de efterfølgende fænomener af plasticitet. I disse undersøgelser, protokollen af AC ablations blev valideret ved anvendelse af fysiologiske (ABR), adfærdsmæssige (startle svar, prepulse hæmning; PPI), og molekylære (DNA microarrays, qPCR samt Western Blot) metoder13,14,15,16,17,18,19. Her, for at dokumentere effekten af vores protokol, vi lade de tre AC ablated rotter overleve i en uge, og indsamlede cochleae under samlingen væv trin til at studere ændringer i udtrykket af de mest relevante AMPA underenheder i voksen øresneglen , GluA2 og GluA3, af qPCR. Sammenligning mellem udskrifter fra AC ablated rotter og sham kontroldyr hvor alle kirurgi processen, men ikke den kortikale ablation blev udført viste en ned-regulering for GluA2, og en op-regulering for GluA3 i begge cochleae (figur 3) , som er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figur 1: billeder af rotte tidsmæssige knoglen på tre forskellige kirurgiske skridt. (A) overførsel af stereotaxisk koordinaterne for AC til den tidsmæssige knoglen. Koordinaterne for de fire punkter er: A: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-8,67 mm. (B) koordinater bruges som reference til at tegne et rektangel på overfladen af den tidsmæssige knoglen, som vil guide åbningen af et vindue. (C) viser vinduet blev åbnet i knoglen efter boring. Meninges med blodkar kan observeres på overfladen af hjernen. R: rostralt, D: dorsale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figur 2: Procedure for at lokalisere læsioner i rotte hjernen. (A) fotografi af den dorsale flade af en AC ablated hjernen med stereotactically implanterede nåle i Lambda og Bregma (ifølge Paxinos og Watson koordinater19). Stiplede linjer Markér positionen af Bregma og Interaural 0 i 9 cm x 9 cm gitter, såvel som i den dorsale overfladen af hjernen. (B) fotografi af den laterale overflade af ablated hjernen overlejret at koordinere kortet over AC. Omkredsen af læsion er mærket med rødt i billedet. Perimeteren for området, AC er mærket i sort i kortet. I dette eksempel er procentdelen af AC ablation med hensyn til det samlede areal besat af AC 84.79%. AC: auditive cortex, IA: inter lydlige, FR: Rhinal revne. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figur 3: ændringer i mRNA niveauer af AMPA-receptoren underenheder GluA2 og GluA3 efter ensidige AC ablations 7 dage efter læsionen. Resultaterne præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse forandringens fold. Ændringer til GluA2 udskrifter er repræsenteret i blå. Ændringer til GluA3 udskrifter er præsenteret i rød. En betydelig nedgang i GluA2 og en stigning i GluA3 er observeret i begge cochleae (ipsi - og kontralaterale til ablation) i forhold til sham kontrol med ingen kortikale ablations 7 dage efter operationen; Dette er efter aftale med vores tidligere resultater19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactically guidede Ablation af rotte auditive Cortex og lokalisering af læsion i hjernen

Vi beskriver en metode til stereotactically guidede placering, eksponering og ablation af den auditive cortex i rotter. Lokalisering af ablation er vurderet ved hjælp af en koordinere kort postmortem.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Stereotaktisk Injektion af MicroRNA-udtrykkende lentivira til Mouse Hippocampus CA1 Region og vurdering af de Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Omfattende analyse af transskription Dynamics fra Brain Prøver Efter Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Stimulating the Lip Motor Cortex with Transcranial Magnetic Stimulation

Stimulering af Lip Motor Cortex med Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has proven to be a useful tool in investigating the role of the articulatory motor cortex in speech perception. ...

Infant Auditory Processing and Event-related Brain Oscillations

Infant Auditory Processing og event-relaterede Brain Svingninger

Rapid auditory processing and acoustic change detection abilities play a critical role in allowing human infants to efficiently process the fine spectral ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Den modificerede Hole Board - Måling Behavior, Erkendelse og social interaktion hos mus og rotter

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus nerve stimulation som et redskab til at fremkalde Plasticitet i Pathways Relevant for Extinction Læring

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to the Unilateral Hemisphere of Rat Brain

Gentagne Transcranial magnetisk stimulation til den ensidige halvkugle af Rat Brain

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, ...

Using Eye Movements Recorded in the Visual World Paradigm to Explore the Online Processing of Spoken Language

Ved hjælp af øjenbevægelser registreres i den visuelle verden paradigme at udforske Online behandling af talesprog

In a typical eye tracking study using the visual world paradigm, participants' eye movements to objects or pictures in the visual workspace are recorded ...

An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses

En instrumenteret Pull-Test til at karakterisere Postural svar

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is a common and disabling deficit in Parkinson's disease. To assess postural reflexes, ...

Transcranial Direct Current Stimulation for Online Gamers

Transcranial direkte strøm stimulering til online gamere

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that applies a weak electric current to the scalp to modulate ...