Name: stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van het ministerie van economie en concurrentievermogen (MINECO) van de regering van Spanje, SAF2016-78898-C2-2-R.

deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met beide Spaanse verordeningen (Koninklijk decreet 53/2013 - wet 32/2007) en richtsnoeren van de Europese Unie (richtlijn 2010/63/EU) over de verzorging en het gebruik van dieren in biomedisch onderzoek.
 1. Voorbereiding van de Rat Opmerking: We de experimenten uitgevoerd in mannelijke ratten voorkomen dat zich hormonale veranderingen.
<ol><li>Verdoving het dier met een mix van ketamine hydrochloride (30 mg/kg) en xylazine waterstofchloride (5 mg/kg) geïnjecteerd intramuscularly; met deze dosis, de rat moet worden diep verdoofd voor ongeveer 1 h.</li>
	<li>Knijpen de rat &#39; s teen; afwezigheid van de terugtrekking van reflex geeft aan dat het dier volledig bewusteloos. Als de rat op de snuifje reageert, Geef aanvullende verdoving op eenderde van de startdosis.</li>
	<li>Scheren van de hoofdhuid en het chirurgische gebied met Povidon-jodium ontsmet.</li>
	<li>Plaats het dier op een verwarming pad te handhaven een temperatuur van 38 ° C en stabiliseren van het dier &#39; s hoofd in een stereotaxic frame met behulp van twee oor bars en een hap-bar. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het tympanic membraan met de balken oor piercing.</li>
	<li>Bescherm de ogen door een daling van de oogheelkundige gel of serum zoutoplossing toe te passen op elk oog.</li>
</ol> 2. Locatie van de AC in de temporale bot van de Rat <ol><li>met behulp van een scalpel, het maken van een sneetje langs de middellijn bloot van de schedel en intrekken van het beenvlies die betrekking hebben op het oppervlak van de schedel.</li>
	<li>Gebruiken een steriele katoen-tip om te voorzichtig verwijderen bloed die betrekking hebben op het oppervlak van de schedel te visualiseren van bregma, lambda en interaural 0 volgens de Paxinos en Watson atlas van de rat hersenen 22.</li>
	<li>Maak een incisie in de musculus temporalis in de buurt van de dorsale plaatsing op de schedel met een scalpel. Trek de spier met behulp van een naald en hechtdraad materiaal, en lossen van het materiaal van de hechtdraad naar het stereotactische frame; Dit zal blootstellen de temporale bot. Als bloeden optreedt, spoelen met koud steriele zoutoplossing.</li>
	<li>Plaats een steriele rechte naald in de stereotactische micromanipulator, ervoor te zorgen dat het volledig beveiligd.</li>
	<li>Langzaam lager de naald totdat het klopt boven het oppervlak van de schedel, zodat het uiteinde van de naald is ingesteld op interaural 0. Dit punt als een nul, en coördinaten van dit punt bepalen.</li>
	<li>Afhankelijk van de hersenen interessegebied, variëren de stereotactische coördinaten. Deze coördinaten bepalen met behulp van de Paxinos en Watson atlas van de rat hersenen 22. Zodra de coördinaten zijn bepaald, verplaatsen de naald aan die coördinaten.</li>
	<li>Richten op het AC met behulp van de coördinaten van de volgende vier punten: A: A / P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-8.67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-8.67 mm. lager de naald naar rechts boven de temporale bot te visualiseren van elk van deze vier punten. Met behulp van een viltstift, Markeer de punten op de temporale bot en sluit ze om een rechthoek; de rechthoek zal dienen als een gids voor het openen van een venster in het bot ( Figuur 1).</li>
</ol> 3. Chirurgische blootstelling van de AC <ol><li>Open het venster met behulp van een elektrische boor en een kleine boor bits (0.6 mm Ø). Boor de omtrek van de rechthoek bij 8.000 tpm tot het bot geeft weg. Koel het boren oppervlak door spoelen met koud steriele zoutoplossing om schade te voorkomen aan subcorticale structuren. Wanneer het bot manier geeft, kan een daling van de weerstand worden gedetecteerd. Wees voorzichtig om niet de hersenen boren.</li>
	<li>Wanneer de grenzen los zijn, optrekken van het betreffende bot met een fijne Tang en op te slaan in een koude steriele zoutoplossing.</li>
</ol> 4. Ablatie van de AC <ol><li>met behulp van een chirurgische Microscoop (10 X), zachtjes de hersenvliezen snij met een microchirurgische mes en verwijder ze met behulp van twee boete-puntige pincet. Als bloeden optreedt, spoelen met koud steriele zoutoplossing.</li>
	<li>Gecombineerd zachtjes de AC met behulp van een chirurgische zuig-apparaat (bar druk-0.24) gekoppeld aan een steriele naald van 20 G botte uiteinde. Dit punt is van cruciaal belang en moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd: alleen de zes corticale lagen en niet de onderliggende witte stof gecombineerd.</li>
	<li>Gecombineerd tot de perforating slagaders stoppen met bloeden.</li>
	<li>Wanneer de aspiratie is voltooid, bestrijken de gewonde gebied met het uitgepakte bot en toepassen van een absorbeerbare hemostatische gaas.</li>
	<li>Laat de musculus temporalis herstellen van de oorspronkelijke positie, en dan suture de huid met behulp van de wond clips (9 mm). Antibiotische zalf van toepassing (Zie de Tabel van de materialen). Blijven van toepassing zalf op de wond tweemaal daags gedurende drie dagen. 
	Opmerking: Elke toepassing bestaat uit een dun laagje toegepast op de wond.</li>
	<li>Injecteer buprenorfine subcutaan in de achterkant van de rat (0,05 mg/kg) als een pijnstillend 1 h na de operatie, en vervolgens elke 8 h tijdens 72 h.</li>
	<li>Houden van het dier op de verwarming pad, totdat het wakker, en terug te sturen naar zijn kooi van de behuizing terug te vorderen.</li>
	<li>Huis dieren individueel om te voorkomen dat cage stuurlieden aanraken van het sutured gebied, en sommige items verrijking bieden. Het zaagsel dagelijks wijzigen om te voorkomen dat infectie, en zorgvuldig controleren dat het dier goed herstelt en geen tekenen van ongemak niet toont.</li>
</ol> 5. Weefsel collectie Let op: bij de behandeling van paraformaldehyde (PFA), zowel effen als waterige, Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en gebruik van een veiligheid kabinet.
 Opmerking: 750 mL formaldehyde oplossing voor te bereiden door het oplossen van 4% (m/v) PFA in 1 x fosfaatgebufferde oplossing (PBS) met behulp van warmte (55 ° C). Filtreer de formaldehyde-oplossing met filtreerpapier. Bereiden Ringer &#39; s oplossing door ontbinding van 8,5 g NaCl, KCl, en 0.2 g NaHCO 3 in 1000 mL water 0,25 g (oplossing pH = 6.9).
<ol><li>Laat het dier overleven voor zolang dat nodig is voor de studie. Wanneer het onderzoek uitgevoerd met de AC ablated rat is voltooid, terminaal anaesthetize door intraperitoneale injectie van 0,1 mL van natrium pentobarbital (60 mg/kg). Beoordelen van de diepte van de verdoving door teen knijp- en het ontbreken van terugtrekking reflex.</li>
	<li>Wanneer het dier is diep verdoofd, uitvoeren een intracardiac perfusie 23 125 ml Ringer &#39; s oplossing gevolgd door 750 mL formaldehyde oplossing met behulp van een naald meter van 1,8 mm binnendiameter.</li>
	<li>Wanneer de perfusie is voltooid, de rat op het eerste cervicale wervel onthoofden.</li>
	<li>Gebruik schaar te verwijderen van de huid en de spieren van het hoofd en bloot de schedel. Gebruiken van schaar te knippen, het foramen magnum openen en verwijderen van de achterkant van de schedel.</li>
	<li>Maken een transversal gesneden in het orbitale bot met behulp van Spencer schaar, en gebruik rongeurs te snijden langs de bovenrand van de schedel aan het blootstellen van de hersenen. Wees voorzichtig niet aan de hersenen beschadigen.</li>
	<li>Zodra de hersenen is blootgesteld, verwijder voorzichtig de dura mater met behulp van fine-puntige pincet. Een vinger gebruiken voor zachtjes schep onder en verheffen de hersenen. Verhogen van de hersenen en de zenuwen unt knippenIl het is gratis. Onderdompelen van de hersenen in formaldehyde oplossing en op te slaan bij 4 ° C gedurende 24 h.</li>
</ol> 6. Lokalisatie van de letsels van het AC <ol><li>na na fixatie, zorgvuldig plaats de hersenen in een Sagittaal rat hersenen matrix bloot van de laterale oppervlak van de hersenen.</li>
	<li>Plaats een camera 21 cm boven het oppervlak van de schors met behulp van een camera houder, selecteer het &#34; super macro-opnamen &#34; modus, en neem een foto van het oppervlak van de hersenen.</li>
	<li>Plaats van de hersenen in een coronale rat hersenen matrix bloot het dorsale oppervlak van de hersenen, en neem een andere foto.</li>
	<li>Met behulp van een editor die afbeelding, open de afbeeldingen en ze verkleinen met 50% gemakkelijker mee kunt werken. Identificeren van de bregma, lambda en interaural 0 verwijzingen op de foto volgens Paxinos en Watson coördinaten 19 en markeer hun positie in de foto's ( Figuur 2). Teken de omtrek van de ablatie over de laterale foto van de hersenen. Berekenen van de omtrek.</li>
	<li>Importeren de coördinaat kaart waar de primaire (A1) en secundaire regio's (dorsale en ventrale Cortices) van het Keuzeaxioma zijn gelegen 18 tot het dossier van de editor wordt waar u met de foto's werkt. Klik op de kaart en sleep deze om het aan de laterale foto van de ablated hersenen superponeren.
	<ol><li>Maken van de bregma en lambda verwijzingen van de coördinaat kaart samenvallen met de referenties van het bregma en lambda geïdentificeerd in het beeld van de laterale hersenen.</li>
		<li>Het rhinal horizontalis gebruiken als referentie om het beeld van de hersenen naar de kaart, en laten samenvallen ( figuur 2B).</li>
	</ol></li> <li>Berekenen de percentage van de laesie ten opzichte van de ruimte bezet door de AC.</li></ol>

<ol>
	<li>Talwar, S. K., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+frequency+discrimination+in+the+white+rat.">Auditory frequency discrimination in the white rat.</a> Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).</li><li>Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogram+of+the+hooded+Norway+rat.">Audiogram of the hooded Norway rat.</a> Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).</li><li>Malmierca, M. S., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+System.">Auditory System.</a> The Rat Nervous System. , 995-1080 (2004).</li><li>Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Auditory+Efferent+System:+New+Insights+from+Cortex+to+Cochlea.">Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea.</a> Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).</li><li>Dinse, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+Case+for+Enrichment.+Focus+on+"Environmental+Enrichment+Improves+Response+Strength,+Threshold,+Selectivity,+and+Latency+of+auditory+cortex+Neurons.".">Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.".</a> J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).</li><li>Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+learning+shapes+the+neural+code+for+stimulus+magnitude+in+primary+auditory+cortex.">Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+Pathways+Determine+Breadth+of+Subthreshold+Frequency+Receptive+Fields+in+Primary+auditory+cortex.">Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex.</a> J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).</li><li>Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mammalian+auditory+cortex+in+the+perception+of+elementary+sound+properties.">Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties.</a> J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).</li><li>Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+synaptic+inhibition+can+create+intensity-tuned+auditory+cortex+neurons.">Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons.</a> Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).</li><li>Le&#243;n, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamam&#233;, C. M., Delano, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortex+basal+activity+modulates+cochlear+responses+in+chinchillas.">Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas.</a> PLOS ONE. 7 (4), e36203 (2012).</li><li>Jager, K., Kossl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticofugal+Modulation+of+DPOAEs+in+Gerbils.">Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils.</a> Hear Res. 332, 61-72 (2016).</li><li>Dragicevic, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Olivocochlear+Reflex+Strength+and+Cochlear+Sensitivity+are+Independently+Modulated+by+auditory+cortex+Microstimulation.">The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).</li><li>Clarkson, C., Herrero-Turri&#243;n, M. J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Auditory+Deafferentation+Induces+Long-Term+Plasticity+in+the+Inferior+Colliculus+of+Adult+Rats:+Microarray+and+qPCR+Analysis.">Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis.</a> Front Neural Circuits. 6, 86 (2012).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#769;an, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regulation+in+calretinin+staining+in+the+rat+inferior+colliculus+after+unilateral+auditory+cortical+ablation.">Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation.</a> J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+down-regulation+of+sound-induced+c-Fos+protein+expression+in+the+inferior+colliculus+after+ablation+of+the+auditory+cortex.">Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex.</a> Front Neuroanat. 4, 141 (2010).</li><li>Hunter, K. P., Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bilateral+lesions+of+auditory+cortex+in+mice+on+the+acoustic+startle+response.">Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response.</a> Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).</li><li>Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+input+and+efferent+activity+regulate+the+expression+of+molecules+involved+in+cochlear+micromechanics.">Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics.</a> Front Syst Neurosci. 8, 253 (2014).</li><li>Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+of+brainstem+electrical+evoked+responses+to+sound+after+restricted+ablation+of+the+auditory+cortex.">Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex.</a> PLOS ONE. 8 (9), e73585 (2013).</li><li>Lamas, V., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+auditory+cortex+results+in+changes+in+the+expression+of+neurotransmission-related+mRNAs+in+the+cochlea.">Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea.</a> Hear Res. 346, 71-80 (2017).</li><li>Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+tonotopic+core+of+rat+auditory+cortex:+physiological+evidence+for+a+posterior+field.">Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field.</a> J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).</li><li>Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+auditory+receptive+field+organization+across+five+cortical+fields+in+the+albino+rat.">Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat.</a> J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2005).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564 (2012).</li></ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van eventuele commerciële of financiële relaties kan worden opgevat als een mogelijke belangenconflicten.

Een succesvolle hersenoperatie hangt af van twee factoren: levend houden van het dier, tijdens en na de procedure, en nauwkeurig lokaliseren van het interessegebied. Ervoor te zorgen dat de rat is diep verdoofd tijdens de operatie (de terugtrekking reflex testen) en ontvangt voldoende analgetica en niet-ototoxisch antibiotica overleven helpen moeten. Bovendien moet de rat op een verwarming pad worden bewaard totdat het wakker uit de narcose te voorkomen hypothermie. Wordt de gevoeligheid voor infectie zal afnemen, en goede techniek is essentieel: dieren zal halen op hun oplawaai wond, dus ze moeten strak genoeg om te voorkomen dat verwijdering zonder teveel spanning op de wond worden geïmplanteerd.
Nauwkeurig vinden de AC (of enig ander corticale gebied), is het belangrijk om te bepalen van de positie van bregma, lambda en interaural 0 om ze te gebruiken als verwijzingen naar de grenzen van de gerichte regio berekenen. Een fout bij de berekening van de coördinaten zal resulteren in de gedeeltelijke ablatie van AC of de ongewenste aspiratie van andere omliggende gebieden. Zo moet de naald tip alleen raken het bot bij interaural 0, en dan het vertalen van de coördinaten van het antero-posterior en medio-laterale volgens wat beschreven in dit protocol wordt.
In dit manuscript, hebben we ook beschreven hoe operatief bloot en de AC lasertherapie. Er zijn drie belangrijke stappen: het boren proces, de opening en de verwijdering van de hersenvliezen en de ablatie door aspiratie. Boren moet worden uitgevoerd bij een lage snelheid met minimale druk, zoals een snelle boren genereert warmte die in de buurt van subcorticale structuren kan beïnvloeden. Handhaven van een lage snelheid en koeling van het boren gebied met koude steriele zoutoplossing moeten echter schade voorkomen. Bovendien, is minimale druk essentieel om te voorkomen dat een plotselinge onderbreking van de schedel en latere schade aan de onderliggende cortex. De openings- en verwijdering van de hersenvliezen die betrekking hebben op de AC moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om te voorkomen dat het breken van de bloedvaten. Als bloeden optreedt, de vroege en late prognose is over het algemeen ongunstig en men kan zich afvragen of een dergelijk dier voldoet aan de criteria van de opneming voor een betrouwbare studie. In dit geval raden we euthanasie. Tot slot moet de aspiratie (waarschijnlijk het moeilijkste aspect bij het uitvoeren van een effectieve laesie), worden beperkt tot de grijze stof. Er zijn twee indicatoren die kunnen helpen bij het detecteren van de aanwezigheid van de witte stof: (1) een wijziging in het kleurcontrast, als de witte stof is lichter dan de grijze stof; en (2) de beëindiging van het bloeden uit de perforating slagaders.
Na iedere manipulatie uitgevoerd in de hersenen, is het noodzakelijk om te beoordelen van de localisatie, grootte en uitbreiding van de procedure die is gemaakt in de cortex voor de daaropvolgende analyse en validatie van de gegevens die zijn verkregen van het dier. In dit manuscript, we in detail te beschrijven hoe de ablatie uitgevoerd in de cortex die met behulp van een coördinaat kaart eerder beschreven door onze fractie18lokaliseren. Deze kaart werd gebouwd met behulp van anatomische verwijzingen seriële sectie reconstructies van histologische secties, gecorreleerd met de Paxinos en Watson atlas van de rat hersenen22verkregen. Dienovereenkomstig, de kaart maakt een onderscheid tussen de primaire (A1) en secundaire cortices (dorsale en ventrale) van de AC. Het belangrijkste voordeel van deze coördinaat kaart is dat het mogelijk de snelle lokalisatie van de laesie maakt door een foto genomen van de laterale oppervlak van de hersenen in een matrix Sagittaal hersenen geplaatst boven elkaar plaatsen. Een ander voordeel is dat laboratoria met minder ervaring in anatomie de kaart gebruiken kunnen door het aan te passen aan hun dierlijke modellen. Het is alleen worden de afstanden tussen de bregma, lambda en interaural 0 verwijzingen in de hersenen van een controle, geperfundeerd, en schaal van de kaart omhoog of omlaag dienovereenkomstig. Het Rhinal horizontalis gebruiken als referentie om de afbeelding van de hersenen naar de kaart. De diepte van het baarmoederslijmvlies worden niet in deze coördinaat kaart, bepaald, dus het moet worden bepaald in de hersenen histologische secties.
De combinatie van stereotactische methoden met de chirurgische blootstelling van de AC zijn fundamentele methoden die gemakkelijk kunnen worden aangepast door een onderzoeker die wil richten op de AC in de rat. Dit zou voor een acute experiment of een waarvoor implantatie van permanente apparaten. Bovendien is de chirurgische ablatie van de AC eerder gebruikt als een model voor het bestuderen van de effecten van chronische corticale ontbering in hoorzitting. AC ablations kunnen ook worden gebruikt om het bestuderen van de effecten die eenzijdige AC ablations uitoefenen in andere corticale gebieden, of dienen als een model van een beroerte. Dus zijn de experimentele designs die hier beschreven nuttige methoden die kunnen worden toegepast, afzonderlijk of in combinatie met een brede waaier van experimentele designs.

De rat is een van de meest gebruikte dierlijke modellen in de auditieve neurowetenschappen. De robuustheid van het gedrag maakt het kundig voor werkzaamheden voor honderden proeven per dag. De gevoeligheid en de spectrale gezichtsscherpte voor hoorzitting1,2, en de anatomische en functionele organisatie van het centrale systeem, vergelijkbaar met andere zoogdieren3, maken de rat een geschikt dierlijk model voor het analyseren van een breed scala aan onderzoeksthema's in de auditieve neurowetenschappen. De rat auditieve cortex (AC), in het bijzonder, het onderwerp geweest van verschillende anatomische en fysiologische studies die hebben geprobeerd om te begrijpen van de structuur, organisatie en rol in geluidsverwerking3. Tegenwoordig, is de AC populair geworden onder neurowetenschappers kochten ervaring-afhankelijkheid plasticiteit, auditieve perceptie, de synaptische basis van receptieve veld organisatie en de corticale controle van de geluidsverwerking in de subcorticale auditieve kernen4,5,6,7,8,9. Om de uitdagingen die deze nieuwe benaderingen opleveren, zal de procedures die kunnen nauwkeurig zoeken en de AC operatief te geven onderzoeksinspanningen versnellen. Stereotactische technieken maken het gemakkelijk om te lokaliseren specifieke regio's binnen de hersenen zonder fysiologie testen. Hoewel de hersenen grootte verschilt enigszins tussen dieren, kan de locatie van een bepaald gebied van de hersenen worden bepaald met behulp van stereotactische coördinaten instellen van bezienswaardigheden op de schedel van de hersenen van de rat.
De beperkte ablatie van de AC is de chirurgische verwijdering van de sensorische regio van de cortex meest rechtstreeks verband houden met de hoorzitting. In tegenstelling tot andere methoden gebruikt voor het blokkeren van de activiteit van de AC, zoals koeling of lokale lidocaïne injecties10,11,12, de chirurgische ablatie van de resultaten van de AC in de chronische verlies van functie. AC ablations zijn dus meer geschikt voor het bestuderen van de langetermijneffecten van de corticale vrijheidsstraf, alsmede de latere verschijnselen van plasticiteit van de laesie. De combinatie van stereotactische methoden met chirurgische ablations van de AC is met succes gebruikt voor het bestuderen van de fysiologische, gedragsmatige en moleculaire effecten van corticale controle ontbering13,14,15 ,16,17,18,19. Bijvoorbeeld, is een rat-model met bilaterale AC ablations gebruikt voor het bestuderen van de effecten van corticale ablatie in de auditieve schrikken reflex en auditieve brainstem Reacties (ABR)16. Wij hebben onlangs de effecten dat unilaterale versus bilaterale ablations van de rat AC producten in ABR drempels, amplitudes en latencies op verschillende tijdstippen vergeleken na de verwonding18. Bovendien, is het model van de rat van beperkende AC ablatie ook gebruikt om te bestuderen van het effect van corticofugal traject degeneratie in de inferieure collicus13,14,15 en het binnenoor17 ,19. Nadat een dergelijke manipulatie wordt uitgevoerd in de hersenen, is het noodzakelijk om te beoordelen van de localisatie, grootte en uitbreiding van de laesies gemaakt in de cortex. Hoewel zeer nuttig is, zijn de belangrijkste beperking van tonotopic kaarten op basis van neuronale reacties20,21 het elektrofysiologische technieken die nodig zijn om te zoeken van de auditieve velden in de rat hersenen. Aangezien niet alle laboratoria hebben de benodigde apparatuur en/of expertise om dergelijke opnames te maken, we hebben een coördinaat kaart gebaseerd op de overdracht van de grenzen van de cytoarchitectural van de AC naar een beeld van de hersenen oppervlak18gebouwd. Deze kaart kan zeer nuttig zijn voor de AC geen fysiologie testen vinden.
Dit protocol beschrijft een methode voor de stereotactically geleide locatie, chirurgische belichting en ablatie van de AC bij ratten. Het beschrijft ook hoe onze coördinaat kaart18 te gemakkelijk het lokaliseren van de uitbreiding van de laesie boven de afbeelding van het oppervlak van de ablated hersenen gebruiken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Ins.</td>
			<td>900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>WILD M650 Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>DAGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor</td>
			<td>W&#38;H elco</td>
			<td>5118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond burr</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>GD021R</td>
			<td>0.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suction device</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>Atmoforte E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td></td>
			<td>30 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Meda</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline serum</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G sterile needle</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>10.331.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Indivior UK</td>
			<td>Buprex</td>
			<td>0.01-0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.120.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spencer scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.804.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical knife</td>
			<td>MSP</td>
			<td>7503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostatic gauze</td>
			<td>Surgicel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saggital rat Brain Matrix</td>
			<td>Activational systems Inc.</td>
			<td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus 5.1 MP</td>
			<td>C-5060 wide zoom</td>
			<td>lens F2.8-4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Reflex 9</td>
			<td></td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canvas 12</td>
			<td>ACD Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 1.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separatory funnel</td>
			<td>labbox</td>
			<td>11409</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

De rat auditieve cortex (AC) wordt steeds populairder onder auditieve neurowetenschappen onderzoekers die geïnteresseerd in ervaring-afhankelijkheid plasticiteit, auditieve perceptuele processen en corticale controle van geluid zijn-verwerking in de subcorticale auditieve kernen. Om nieuwe uitdagingen, een procedure nauwkeurig vinden en operatief bloot de auditieve cortex deze onderzoeksinspanning zou versnellen. Stereotactische Neurochirurgie is het routinematig gebruikt in pre-klinisch onderzoek in diermodellen om engraft een naald of elektrode in een vooraf gedefinieerde locatie in de auditieve cortex. In het volgende protocol gebruiken we stereotactische methoden in een nieuwe manier. We identificeren vier coördinaat punten over het oppervlak van de temporal bone van de rat te definiëren van een venster dat, eenmaal geopend, nauwkeurig zowel de primaire (A1 bloot) en secundaire (dorsale en ventrale) cortices van de AC. met behulp van deze methode, wij Voer een chirurgische ablatie van de AC. Nadat een dergelijke manipulatie wordt uitgevoerd, is het noodzakelijk om te beoordelen van de localisatie, grootte en uitbreiding van de laesies gemaakt in de cortex. Zo beschrijven we ook een methode om gemakkelijk vinden de AC ablatie postmortale met behulp van een coördinaat kaart gebouwd door de overdracht van de grenzen van de cytoarchitectural van de AC aan de oppervlakte van de hersenen. De combinatie van de stereotactically-geleide locatie en ablatie van de AC met de lokalisatie van de gewonde gebied in een coördinaat kaart postmortale vergemakkelijkt de validatie van het dier verkregen informatie, en leidt tot een betere analyse en begrip van de gegevens.

Wij uitgevoerd een stereotactically geleide locatie, chirurgische belichting en eenzijdige ablatie van de AC in drie Wistar ratten. De lokalisatie van de laesie bevestigd dat ablations uitgevoerd in de drie ratten de grote deelsectoren van de AC (primaire dorsale en ventrale cortices) aangetast, en bestond uit een bereik van 80 tot 100% van de totale oppervlakte van AC (figuur 2B).
Het protocol hier beschreven voor het uitvoeren van beperkende AC ablations heeft eerder gebruikt in ons laboratorium te bestuderen van de langetermijneffecten van corticale controle ontbering in de subcorticale auditieve kernen, alsmede de latere verschijnselen van plasticiteit. In deze studies, het protocol van AC ablations werd gevalideerd door het toepassen van de fysiologische (ABR), gedragsmatige (schrikken van de reacties, remming; prepulse PPI), en moleculaire (DNA microarrays, qPCR en Western Blot) methoden13,14,15,16,17,18,19. Hier, om de doelmatigheid van onze protocol aan te tonen, we laten de drie AC ablated worden ratten overleven gedurende één week, en verzamelde de cochleae tijdens de weefsel-collectie stap te bestuderen van de veranderingen in de expressie van de meest relevante AMPA subeenheden aanwezig in het volwassen slakkenhuis , GluA2 en GluA3, door qPCR. De vergelijking tussen de transcripten van AC ablated worden ratten en sham controledieren waar al het operatie proces maar niet de corticale ablatie werd uitgevoerd toonde een down-verordening voor GluA2, een up-verordening en de voor GluA3 in beide cochleae (Figuur 3) , die is in overeenstemming met onze eerdere studie19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figuur 1: beelden van de rat temporale bot op drie verschillende chirurgische stappen. (A) overdracht van de stereotaxic coördinaten van de AC tot op het bot temporale. De coördinaten van de vier punten zijn: A: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-8.67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-8.67 mm. (B) de coördinaten worden gebruikt als een verwijzing om een rechthoek op het oppervlak van de temporale-bot die het openen van een venster leidt. (C) toont het venster geopend in het bot na het boren. De hersenvliezen met bloedvaten kunnen worden waargenomen op het oppervlak van de hersenen. A: rostraal, D: dorsale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figuur 2: Procedure voor het lokaliseren van laesies in de rat hersenen. (A) foto van het dorsale oppervlak van de hersenen van een AC ablated worden met stereotactically geïmplanteerde naalden in Lambda en Bregma (volgens Paxinos en Watson coördinaten19). Stippellijnen Markeer de positie van Bregma en Interaural 0 in het raster van 9 x 9 cm, zo goed als in het dorsale oppervlak van de hersenen. (B) foto van de laterale oppervlak van de ablated hersenen bovenop naar de coördinaat kaart van de AC. De omtrek van de laesie heet in rood weergegeven in de afbeelding. De omtrek van het AC-gebied heet in het zwart in de kaart. In dit voorbeeld is het percentage van AC ablatie met betrekking tot de totale oppervlakte bezet door de AC 84.79%. AC: auditieve cortex, IA: inter auditieve, FR: Rhinal horizontalis. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figuur 3: veranderingen in de mRNA niveaus van AMPA receptor subeenheden GluA2 en GluA3 na eenzijdige AC ablations 7 dagen na laesie. Resultaten worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking van de verandering van de vouw. Wijzigingen voor GluA2 afschriften zijn vertegenwoordigd in het blauw. Wijzigingen voor GluA3 afschriften worden gepresenteerd in het rood. Een aanzienlijke afname van de GluA2 en een toename van GluA3 wordt waargenomen in beide cochleae (ipsi - en contralaterale aan de ablatie) ten opzichte van sham besturingselementen met geen corticale ablations 7 dagen na de operatie; Dit is in overeenstemming met onze eerdere resultaten19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactically-geleide ablatie van de auditieve Cortex van de Rat en de lokalisatie van de laesie in de hersenen

Beschrijven we een methode voor de stereotactically-geleide locatie, belichting en ablatie van de auditieve cortex in ratten. De lokalisatie van de ablatie wordt beoordeeld met behulp van een coördinaat kaart postmortale.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Stimulating the Lip Motor Cortex with Transcranial Magnetic Stimulation

Het stimuleren van de Lip Motor Cortex met transcraniële magnetische stimulatie

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has proven to be a useful tool in investigating the role of the articulatory motor cortex in speech perception. ...

Infant Auditory Processing and Event-related Brain Oscillations

Infant Auditieve Verwerking en Event-gerelateerde Brain Oscillations

Rapid auditory processing and acoustic change detection abilities play a critical role in allowing human infants to efficiently process the fine spectral ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

De Modified Hole Board - Het meten van gedrag en cognitieve en sociale interactie bij muizen en ratten

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Nervus Vagus Stimulatie als een Tool om plasticiteit te induceren in Pathways Relevant voor Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to the Unilateral Hemisphere of Rat Brain

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation aan de eenzijdige halfrond van de hersenen van de rat

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, ...

Using Eye Movements Recorded in the Visual World Paradigm to Explore the Online Processing of Spoken Language

Met behulp van oogbewegingen die worden opgenomen in de visuele wereld paradigma te verkennen van de Online verwerking van gesproken taal

In a typical eye tracking study using the visual world paradigm, participants' eye movements to objects or pictures in the visual workspace are recorded ...

An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses

Een Test van de geïnstrumenteerde Pull te karakteriseren posturale reacties

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is a common and disabling deficit in Parkinson's disease. To assess postural reflexes, ...

Transcranial Direct Current Stimulation for Online Gamers

Transcraniële directe stroom stimulatie voor online gamers

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that applies a weak electric current to the scalp to modulate ...