Name: stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Ministero dell'economia e competitività (MINECO) del governo di Spagna, SAF2016-78898-C2-2-R.

questo studio è stato effettuato in stretta conformità con entrambi i regolamenti spagnoli (Royal decreto 53/2013 - legge 32/2007) e orientamenti dell'Unione europea (direttiva 2010/63/UE) sull'uso di animali nella ricerca biomedica e manutenzione.
 1. Preparazione del ratto Nota: abbiamo effettuato gli esperimenti in ratti maschii di evitare cambiamenti ormonali.
<ol><li>Anesthetize l'animale utilizzando un mix di ketamina cloridrato (30 mg/kg) e xilazina cloridrato (5 mg/kg) iniettato per via intramuscolare; con questa dose, ratto dovrebbe essere anestetizzato per circa 1 h.</li>
	<li>Pizzicare il ratto &#39; punta s; assenza di un ritiro riflesso indica che l'animale è pienamente cosciente. Se il ratto risponde per il pizzico, dare l'anestesia complementare a un terzo della dose iniziale.</li>
	<li>Radere il cuoio capelluto e disinfettare l'area chirurgica con povidone-iodio.</li>
	<li>Metti l'animale su un rilievo di riscaldamento per mantenere una temperatura di 38 ° C e stabilizzare l'animale &#39; testa di s in una cornice stereotassica utilizzando due orecchio bar e un morso. Usare cautela per evitare piercing la membrana timpanica con le barre di orecchio.</li>
	<li>Proteggono gli occhi applicando una goccia di gel oftalmico o siero salino per ciascun occhio.</li>
</ol> 2. Posizione di AC nell'osso temporale del ratto <ol><li>usando un bisturi praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che copre la superficie del cranio.</li>
	<li>Utilizzare una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente qualsiasi sangue che copre la superficie del cranio di visualizzare bregma, lambda e interaural 0 secondo l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto 22.</li>
	<li>Fare un'incisione nel muscolo temporale vicino suo inserimento dorsale sul cranio con un bisturi. Tirare il muscolo utilizzando un ago e sutura materiale e fissare il materiale di sutura alla cornice stereotassica; Questo esporrà l'osso temporale. Caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione salina sterile fredda.</li>
	<li>Inserire un ago sterile dritto nel micromanipolatore stereotassica, assicurandosi che sia completamente fissato.</li>
	<li>Abbassare lentamente l'ago fino a quando non è proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell'ago è impostata su 0 interaural. Impostare questo punto come zero e determinarne le coordinate da questo punto.</li>
	<li>a seconda della zona del cervello di interesse, variare le coordinate stereotassica. Determinare le coordinate utilizzando l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto 22. Una volta che le coordinate sono determinate, spostare l'ago per abbinare quelle coordinate.</li>
	<li>Target l'AC utilizzando le coordinate dei seguenti quattro punti: r: A / P =-5,80 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-8,67 mm. abbassare l'ago a destra sopra l'osso temporale per visualizzare ciascuno di questi quattro punti. Usando un pennarello, segnare i punti sull'osso temporale e collegarli al fine di disegnare un rettangolo; il rettangolo servirà come guida per aprire una finestra nell'osso ( Figura 1).</li>
</ol> 3. L'esposizione chirurgica dell'AC <ol><li>Apri finestra utilizzando un trapano elettrico e un piccolo trapano bit (Ø 0,6 mm). Forare il perimetro del rettangolo a 8.000 giri/min fino a quando l'osso dà via. Raffreddare la superficie di perforazione di risciacquo con soluzione salina sterile freddo per evitare danni alle strutture subcortical. Quando l'osso dà modo, può essere rilevato un calo di resistenza. Fare attenzione a non forare il cervello.</li>
	<li>Quando i bordi sono sciolti, tirare verso l'alto l'osso di rivestimento con una pinzetta e memorizzarlo in soluzione fisiologica sterile fredda.</li>
</ol> 4. Ablazione di AC <ol><li>usando un microscopio chirurgico (10x), delicatamente tagliare le meningi con un coltello microsurgical e rimuoverli utilizzando due punte belle forcipe. Caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione salina sterile fredda.</li>
	<li>Aspirare delicatamente l'AC utilizzando un dispositivo di aspirazione chirurgico (pressione -0,24 bar) accoppiato ad un ago sterile di punta smussata 20 G. Questo punto è fondamentale e deve essere eseguita con molta attenzione: aspirare solo sei strati corticali e non la materia bianca sottostante.</li>
	<li>Aspirare fino a quando le arterie perforanti fermare emorragia.</li>
	<li>Quando l'aspirazione è finita, coprire la zona danneggiata con l'osso estratto e applicare una garza emostatica assorbibile.</li>
	<li>Lasciare il muscolo temporale recupera la sua posizione originale e poi suturare la pelle utilizzando clip ferita (9 mm). Applicare la pomata antibiotica (Vedi la Tabella materiali). Continuare ad applicare unguento alla ferita due volte al giorno per tre giorni. 
	Nota: Ogni applicazione è costituita da un sottile strato applicato sulla ferita.</li>
	<li>Buprenorfina iniettare sottocute nella parte posteriore del ratto (0,05 mg/kg) come un analgesico 1 h dopo l'intervento chirurgico e poi ogni 8 h durante 72 h.</li>
	<li>Tenere l'animale il rilievo di riscaldamento fino a quando si sveglia e restituirlo alla sua gabbia di alloggiamento per recuperare.</li>
	<li>Casa animali individualmente per impedire che i compagni di gabbia toccando la zona suturata e fornire alcuni elementi di arricchimento. Cambiare la segatura ogni giorno per prevenire l'infezione e controllare attentamente che l'animale recupera correttamente e non mostra segni di disagio.</li>
</ol> 5. Raccolta di tessuto Attenzione: quando si maneggia la paraformaldeide (PFA), sia solido e acquoso, indossare dispositivi di protezione individuale (PPE) e utilizzare un armadietto di sicurezza.
 Nota: preparare 750 mL di soluzione di formaldeide sciogliendo 4% (p/v) PFA in 1 x soluzione tamponato fosfato (PBS) usando il calore (55 ° C). Filtrare la soluzione di formaldeide con carta da filtro. Preparare la suoneria &#39; s soluzione sciogliendo 8,5 g di NaCl, 0,25 g di KCl e 0,2 g NaHCO 3 in 1.000 mL di acqua (soluzione di pH = 6.9).
<ol><li>Lasciare l'animale di sopravvivere per quanto è necessario per lo studio. Una volta ultimata la ricerca effettuata con il ratto ablato AC, terminali di anestetizzare tramite l'iniezione intra-peritoneale di 0,1 mL di sodio pentobarbital (60 mg/kg). Valutare la profondità dell'anestesia di pizzico di punta e l'assenza del riflesso di ritiro.</li>
	<li>Quando l'animale è anestetizzato, eseguire una perfusione intracardiaca 23 di 125 mL di Ringer &#39; s soluzione seguita da 750 mL di soluzione di formaldeide utilizzando un calibro di 1,8 mm di diametro interno.</li>
	<li>Una volta ultimata l'aspersione, decapitare ratto alla prima vertebra cervicale.</li>
	<li>Usare le forbici per togliere la pelle e muscolo dalla testa ed esporre il cranio. Usare le forbici per tagliare e aprire il foro occipitale e rimuovere la parte posteriore del cranio.</li>
	<li>Fare un trasversale tagliato l'osso orbitale usando le forbici Spencer e Pinze ossivore per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello. Fare attenzione a non danneggiare il cervello.</li>
	<li>Una volta che il cervello è esposto, rimuovere con cautela il mater di dura usando il forcipe ammenda-aguzzo. Utilizzare un dito delicatamente scoop sotto ed elevare il cervello. Alzate il cervello e tagliate i nervi until è gratuito. Immergete il cervello in soluzione di formaldeide e conservarla a 4 ° C per 24 h.</li>
</ol> 6. Localizzazione delle lesioni AC <ol><li>dopo la post-fissazione, posizionare con cura il cervello in una matrice di cervello di ratto sagittale esponendo la superficie laterale del cervello.</li>
	<li>Inserire una fotocamera 21 cm sopra la superficie della corteccia utilizzando un supporto di fotocamera, selezionare il &#34; riprese macro super &#34; modalità e scattare una foto della superficie del cervello.</li>
	<li>Mettere il cervello in una matrice di cervello di ratto coronale esponendo la superficie dorsale del cervello e scattare un'altra foto.</li>
	<li>Utilizzando un programma di editor di immagini, aprire le immagini e scalarle giù 50% per renderlo più facile lavorare con loro. Identificare il bregma, lambda e 0 interaural riferimenti sulla foto secondo Paxinos e Watson coordinate 19 e segnare la loro posizione nelle immagini ( Figura 2). Disegnare il contorno dell'ablazione sull'immagine laterale del cervello. Calcolare il perimetro.</li>
	<li>Importazione la coordinata mappa dove il primario (A1) e regioni secondarie (cortecce ventrale e dorsale) di AC sono trova 18 per il file del programma editor dove si lavora con le immagini. Clicca sulla mappa e trascinarlo per esso a sovrapporre alla fotografia laterale del cervello ablato.
	<ol><li>Rendere il bregma e riferimenti di lambda della mappa delle coordinate coincidono con i riferimenti di bregma e lambda identificati nell'immagine del cervello laterale.</li>
		<li>Utilizzare la fessura rhinal come riferimento per regolare l'immagine del cervello per la mappa e farli coincidere ( Figura 2B).</li>
	</ol></li> <li>Calcola la percentuale della lesione rispetto all'area occupata dall'AC.</li></ol>

<ol>
	<li>Talwar, S. K., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+frequency+discrimination+in+the+white+rat.">Auditory frequency discrimination in the white rat.</a> Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).</li><li>Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogram+of+the+hooded+Norway+rat.">Audiogram of the hooded Norway rat.</a> Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).</li><li>Malmierca, M. S., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+System.">Auditory System.</a> The Rat Nervous System. , 995-1080 (2004).</li><li>Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Auditory+Efferent+System:+New+Insights+from+Cortex+to+Cochlea.">Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea.</a> Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).</li><li>Dinse, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+Case+for+Enrichment.+Focus+on+"Environmental+Enrichment+Improves+Response+Strength,+Threshold,+Selectivity,+and+Latency+of+auditory+cortex+Neurons.".">Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.".</a> J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).</li><li>Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+learning+shapes+the+neural+code+for+stimulus+magnitude+in+primary+auditory+cortex.">Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+Pathways+Determine+Breadth+of+Subthreshold+Frequency+Receptive+Fields+in+Primary+auditory+cortex.">Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex.</a> J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).</li><li>Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mammalian+auditory+cortex+in+the+perception+of+elementary+sound+properties.">Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties.</a> J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).</li><li>Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+synaptic+inhibition+can+create+intensity-tuned+auditory+cortex+neurons.">Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons.</a> Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).</li><li>Le&#243;n, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamam&#233;, C. M., Delano, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortex+basal+activity+modulates+cochlear+responses+in+chinchillas.">Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas.</a> PLOS ONE. 7 (4), e36203 (2012).</li><li>Jager, K., Kossl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticofugal+Modulation+of+DPOAEs+in+Gerbils.">Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils.</a> Hear Res. 332, 61-72 (2016).</li><li>Dragicevic, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Olivocochlear+Reflex+Strength+and+Cochlear+Sensitivity+are+Independently+Modulated+by+auditory+cortex+Microstimulation.">The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).</li><li>Clarkson, C., Herrero-Turri&#243;n, M. J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Auditory+Deafferentation+Induces+Long-Term+Plasticity+in+the+Inferior+Colliculus+of+Adult+Rats:+Microarray+and+qPCR+Analysis.">Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis.</a> Front Neural Circuits. 6, 86 (2012).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#769;an, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regulation+in+calretinin+staining+in+the+rat+inferior+colliculus+after+unilateral+auditory+cortical+ablation.">Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation.</a> J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+down-regulation+of+sound-induced+c-Fos+protein+expression+in+the+inferior+colliculus+after+ablation+of+the+auditory+cortex.">Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex.</a> Front Neuroanat. 4, 141 (2010).</li><li>Hunter, K. P., Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bilateral+lesions+of+auditory+cortex+in+mice+on+the+acoustic+startle+response.">Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response.</a> Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).</li><li>Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+input+and+efferent+activity+regulate+the+expression+of+molecules+involved+in+cochlear+micromechanics.">Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics.</a> Front Syst Neurosci. 8, 253 (2014).</li><li>Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+of+brainstem+electrical+evoked+responses+to+sound+after+restricted+ablation+of+the+auditory+cortex.">Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex.</a> PLOS ONE. 8 (9), e73585 (2013).</li><li>Lamas, V., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+auditory+cortex+results+in+changes+in+the+expression+of+neurotransmission-related+mRNAs+in+the+cochlea.">Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea.</a> Hear Res. 346, 71-80 (2017).</li><li>Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+tonotopic+core+of+rat+auditory+cortex:+physiological+evidence+for+a+posterior+field.">Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field.</a> J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).</li><li>Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+auditory+receptive+field+organization+across+five+cortical+fields+in+the+albino+rat.">Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat.</a> J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2005).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Un intervento chirurgico al cervello successo dipende da due fattori: mantenere l'animale vivo durante e dopo la procedura e localizzare con precisione l'area di interesse. Garantire che il ratto è anestetizzato durante l'intervento (test del riflesso di ritiro) e riceve un'adeguata analgesici e antibiotici non ototossici dovrebbero aiutare la sopravvivenza. Il ratto, inoltre, dovrebbe essere tenuto su un rilievo di riscaldamento fino a quando si sveglia dall'anestesia per evitare l'ipotermia. Sutura farà diminuire la suscettibilità all'infezione, e la tecnica corretta è fondamentale: gli animali vi verrà a prendere al loro clips di ferita, così che deve essere impiantati abbastanza stretto per impedire la rimozione senza porre troppa tensione sulla ferita.
Per individuare con precisione l'AC (o qualsiasi altra area corticale), è importante determinare la posizione di bregma, lambda e interaural 0 a utilizzarli come riferimenti per calcolare i limiti della regione di destinazione. Qualsiasi errore nel calcolo delle coordinate comporterà l'ablazione parziale di AC o l'aspirazione indesiderato di altre zone circostanti. Così, la punta dell'ago deve solo toccare l'osso a interaural 0 e poi tradurre le coordinate antero-posteriore e medio-laterale secondo ciò che è descritto in questo protocollo.
In questo manoscritto, abbiamo anche descritto come chirurgicamente esporre e l'ablazione l'AC. Ci sono tre fasi critiche: il processo di perforazione, l'apertura e la rimozione di meningi e l'ablazione di aspirazione. Foratura deve essere eseguito a bassa velocità con pressione minima, come un'alta velocità di perforazione genera calore che può interessare è vicino a strutture subcortical. Tuttavia, mantenere una bassa velocità e punto di foratura con soluzione salina sterile fredda di raffreddamento dovrebbe impedire eventuali danni. Inoltre, la pressione minima è essenziale per evitare una rottura improvvisa del cranio e del conseguente pregiudizio alla corteccia sottostante. L'apertura e la rimozione delle meningi che coprono l'AC deve essere eseguite con attenzione per evitare la rottura dei vasi sanguigni. Se il sanguinamento si verifica, la prognosi precoce e tardiva è generalmente sfavorevole ed è lecito chiedersi se tale animale soddisfa i criteri di inclusione per uno studio affidabile. Si consiglia in questo caso l'eutanasia. Infine, l'aspirazione (probabilmente l'aspetto più difficile nell'esecuzione di un'effettiva lesione), deve essere limitato alla materia grigia. Ci sono due indicatori che consentono di rilevare la presenza della materia bianca: (1) un cambiamento in contrasto di colore, come la materia bianca è più luminoso rispetto alla materia grigia; e (2) la cessazione del sanguinamento dalle arterie perforanti.
Dopo qualsiasi manipolazione eseguita nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione della procedura effettuata nella corteccia per la successiva analisi e validazione dei dati ottenuti dall'animale. In questo manoscritto, dettagliamo come localizzare l'ablazione eseguita nella corteccia usando una mappa delle coordinate precedentemente descritta dal nostro gruppo di18. Questa mappa è stata costruita utilizzando riferimenti anatomici ottenuti dalle ricostruzioni sezione seriale delle sezioni istologiche, correlate con l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto22. Di conseguenza, la mappa differenzia fra il primario (A1) e cortecce secondarie (dorsale e ventrale) di AC. Il vantaggio principale di questa mappa delle coordinate è che permette la rapida localizzazione della lesione sovrapponendo una foto scattata dalla superficie laterale del cervello inserito in una matrice sagittale del cervello. Un altro vantaggio è che i laboratori con meno esperienza in anatomia possono utilizzare la mappa adattandola ai loro modelli animali. Solo è necessario impostare le distanze tra bregma, lambda e interaural 0 riferimenti in un cervello di controllo irrorato e ridimensionare la mappa verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Utilizzare la fessura Rhinal come riferimento per regolare l'immagine del cervello alla mappa. La profondità dell'ablazione non può essere determinata in questa mappa delle coordinate, così dovrebbe essere determinato nelle sezioni istologiche del cervello.
La combinazione di metodi stereotactic con l'esposizione chirurgica dell'AC sono metodi di base che potrebbero essere facilmente adattati da qualsiasi ricercatore che vuole indirizzare l'AC nel ratto. Questo potrebbe essere per un esperimento acuto o uno che richiede l'impianto di dispositivi permanenti. Inoltre, l'ablazione chirurgica di AC è stato precedentemente utilizzato come modello per studiare gli effetti di privazione cronica corticale in udienza. Ablazioni AC potrebbero essere utilizzati anche per studiare gli effetti che ablazioni unilaterali di AC esercitano in altre aree corticali, o servono come un modello del colpo. Così, i disegni sperimentali descritti qui sono metodi utili che possono essere applicate singolarmente o in combinazione ad una vasta gamma di disegni sperimentali.

Il ratto è uno dei modelli animali più comunemente usati in neuroscienze uditiva. La robustezza del suo comportamento lo rende in grado di lavorare per centinaia di prove al giorno. La sua sensibilità e acutezza spettrale per udienza1,2e l'organizzazione anatomica e funzionale del suo sistema centrale, paragonabile ad altri mammiferi3, fare il topo un modello animale adatto per analizzare una vasta gamma di temi di ricerca in neuroscienze uditiva. La corteccia uditiva di ratto (AC), in particolare, è stato oggetto di numerosi studi anatomici e fisiologici che hanno cercato di capire la sua struttura, organizzazione e ruolo nell'elaborazione del suono3. Oggi, l'AC è diventato popolare tra i neuroscienziati interessati a plasticità esperienza-dipendenza, percezione uditiva, la base sinaptica dell'organizzazione del campo recettivo e del controllo corticale dell'elaborazione del suono nel subcortical uditivo i nuclei4,5,6,7,8,9. Per affrontare le sfide che pongono questi nuovi approcci, procedure che possono individuare con precisione ed esporre chirurgicamente l'AC accelerare gli sforzi di ricerca. Stereotactic tecniche lo rendono facile da localizzare specifiche regioni all'interno del cervello senza test di fisiologia. Anche se le dimensioni del cervello varia leggermente tra gli animali, la posizione di ogni area del cervello può essere determinata utilizzando le coordinate stereotactic impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello del ratto.
L'ablazione con restrizioni di AC è la rimozione chirurgica della regione sensoriale della corteccia più direttamente correlata con problemi di udito. A differenza di altri metodi utilizzati per bloccare l'attività di AC, come raffreddamento o locale lidocaina iniezioni10,11,12, l'ablazione chirurgica dei risultati AC la cronica perdita di funzione. Così, ablazioni AC sono più adatti per studiare gli effetti a lungo termine della privazione corticale, così come i successivi fenomeni di plasticità di lesione. La combinazione di metodi stereotactic con ablazioni chirurgiche di AC è stata utilizzata con successo per studiare gli effetti fisiologici, comportamentali e molecolari del controllo corticale privazione13,14,15 ,16,17,18,19. Ad esempio, un modello del ratto con ablazioni AC bilaterale è stato utilizzato per studiare gli effetti dell'ablazione corticale nel riflesso dello startle uditiva e uditive del tronco cerebrale (ABR) risposte16. Recentemente, abbiamo confrontato gli effetti che unilaterali contro bilaterale ablazioni dei prodotti del ratto AC in soglie ABR, ampiezze e latenze in diversi momenti dopo l' infortunio18. Inoltre, il modello del ratto di ablazione AC restrittiva è stato utilizzato anche per studiare l'effetto di degenerazione di via corticofugal le inferiori collicus13,14,15 e l' orecchio interno17 ,19. Dopo una tale manipolazione avviene nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Anche se molto utile, la principale limitazione di tonotopico mappe basate su risposte neuronali20,21 sono le tecniche elettrofisiologiche necessarie per individuare i campi uditivi nel cervello del ratto. Poiché non tutti i laboratori hanno l'attrezzatura necessaria e/o perizia per fare tali registrazioni, abbiamo costruito una mappa delle coordinate basata sul trasferimento dei limiti cytoarchitectural di AC a un'immagine della superficie del cervello18. Questa mappa può essere molto utile per individuare l'AC senza test di fisiologia.
Il presente protocollo descrive un metodo per la posizione stereotactically guidate, l'esposizione chirurgica e ablazione di AC in ratti. Viene inoltre descritto come utilizzare la nostra mappa delle coordinate18 per localizzare facilmente l'estensione della lesione sopra un'immagine della superficie dei cervelli ablati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Ins.</td>
			<td>900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>WILD M650 Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>DAGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor</td>
			<td>W&#38;H elco</td>
			<td>5118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond burr</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>GD021R</td>
			<td>0.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suction device</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>Atmoforte E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td></td>
			<td>30 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Meda</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline serum</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G sterile needle</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>10.331.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Indivior UK</td>
			<td>Buprex</td>
			<td>0.01-0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.120.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spencer scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.804.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical knife</td>
			<td>MSP</td>
			<td>7503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostatic gauze</td>
			<td>Surgicel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saggital rat Brain Matrix</td>
			<td>Activational systems Inc.</td>
			<td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus 5.1 MP</td>
			<td>C-5060 wide zoom</td>
			<td>lens F2.8-4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Reflex 9</td>
			<td></td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canvas 12</td>
			<td>ACD Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 1.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separatory funnel</td>
			<td>labbox</td>
			<td>11409</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

La corteccia uditiva di ratto (AC) sta diventando popolare tra gli investigatori di neuroscienze uditiva che sono interessati a plasticità esperienza-dipendenza, processi percettivi uditivi e controllo corticale di elaborazione nei nuclei uditivi subcorticali del suono. Per affrontare nuove sfide, una procedura per individuare con precisione e chirurgicamente esporre la corteccia uditiva sarebbe accelerare questo sforzo di ricerca. Neurochirurgia stereotassica è usata ordinariamente in ricerca pre-clinica in modelli animali per attecchire un ago o un elettrodo ad una posizione pre-definita all'interno della corteccia uditiva. Nel protocollo seguente, usiamo metodi stereotactic in modo inedito. Identifichiamo i quattro punti di coordinate sulla superficie del temporal bone del ratto per definire una finestra che, una volta aperto, accuratamente espone sia il primario (A1) e secondario (dorsale e ventrale) cortecce del AC. utilizzando questo metodo, quindi eseguiamo un chirurgico ablazione di AC. Dopo una tale manipolazione viene eseguita, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Così, inoltre descriviamo un metodo per individuare facilmente l'autopsia di ablazione AC utilizzando una mappa delle coordinate costruita trasferendo i limiti cytoarchitectural di AC alla superficie del cervello. La combinazione della posizione stereotactically-guida e l'ablazione di AC con la localizzazione della zona danneggiata in un post mortem delle coordinate mappa facilita la convalida delle informazioni ottenute dall'animale e conduce ad una migliore analisi e comprensione dei dati.

Abbiamo effettuato una posizione stereotactically guidate, l'esposizione chirurgica e ablazione unilaterale di AC in tre ratti Wistar. La localizzazione della lesione ha confermato che ablazioni eseguite nei tre ratti ha invaso le principali suddivisioni di AC (cortecce primarie, dorsale e ventrale) e comprende una gamma di 80 al 100% dell'area totale di AC (Figura 2B).
Il protocollo descritto qui per eseguire ablazioni AC restrittive è stato utilizzato in precedenza nel nostro laboratorio per studiare gli effetti a lungo termine della privazione di controllo corticale nei nuclei uditivi subcorticali, così come i successivi fenomeni di plasticità. In questi studi, il protocollo di ablazioni di AC è stato convalidato applicando fisiologico (ABR), comportamentali (startle risposte, prepulse inibizione; PPI) e molecolari (DNA microarrays, qPCR e Western Blot) metodi13,14,15,16,17,18,19. Qui, per dimostrare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo lasciato tre ratti AC ablazione sopravvivere per una settimana, e raccolti le coclee durante l'accumulazione del tessuto passo per studiare i cambiamenti nell'espressione delle subunità AMPA più rilevanti presenti nella coclea adulta , GluA2 e GluA3, di qPCR. Il confronto tra le trascrizioni da AC ablazione ratti e animali di controllo sham dove tutto il processo di chirurgia ma non l'ablazione corticale è stato effettuato ha mostrato una down-regulation per GluA2 e un su-regolamento per GluA3 a due coclee (Figura 3) , che è in accordo con il nostro precedente studio19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figura 1: immagini dell'osso temporale del ratto alle tre diverse fasi chirurgiche. (A) trasferimento delle coordinate stereotassiche di AC all'osso temporale. Le coordinate dei quattro punti sono: r: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-8,67 mm. (B) le coordinate vengono utilizzate come riferimento per disegnare un rettangolo sulla superficie dell'osso temporale che guiderà l'apertura di una finestra. (C) Mostra la finestra aperta nell'osso dopo la foratura. Le meningi con vasi sanguigni possono essere osservate sulla superficie del cervello. R: rostrale, d: dorsale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figura 2: procedura per l'individuazione di lesioni nel cervello del ratto. (A) fotografia della superficie dorsale di un cervello di AC ablazione con aghi stereotactically impiantati in Lambda e Bregma (secondo Paxinos e Watson coordinate19). Linee tratteggiate segnare la posizione di Bregma e Interaural 0 nella griglia 9 x 9 cm, così come la superficie dorsale del cervello. (B) fotografia della superficie laterale del cervello ablato sovrapposto alla mappa delle coordinate di AC. Il perimetro della lesione è etichettato in rosso nella foto. Il perimetro dell'area di AC è etichettato in nero nella mappa. In questo esempio, la percentuale di ablazione AC rispetto all'area totale occupata dall'AC è 84,79%. AC: corteccia uditiva, IA: inter aural, FR: Rhinal fenditura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figura 3: cambiamenti nei livelli di mRNA di subunità del recettore AMPA GluA2 e GluA3 dopo post-lesione unilaterale del di 7 giorni di AC ablazioni. Risultati sono presentati come media ± deviazione standard del cambiamento di piega. Modifiche per GluA2 trascrizioni sono rappresentate in blu. Cambiamenti per le trascrizioni GluA3 sono presentati in rosso. Una diminuzione significativa in GluA2 e un aumento in GluA3 è osservati in due coclee (ipsi - e controlaterale l'ablazione) relativi comandi finti con nessun ablazioni corticale a 7 giorni dopo l'intervento chirurgico; Questo è in accordo con i nostri precedenti risultati19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactically-guida l'ablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello

Descriviamo un metodo per la posizione stereotactically-guida, l'esposizione e l'ablazione della corteccia uditiva in ratti. La localizzazione dell'ablazione è valutata usando un post mortem delle coordinate mappa.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Ricerca

Comportamento

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Analisi completa di Trascrizione Dynamics da campioni di cervello seguito Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Stimulating the Lip Motor Cortex with Transcranial Magnetic Stimulation

Stimolare il Lip Motor Cortex con la Stimolazione Magnetica Transcranica

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has proven to be a useful tool in investigating the role of the articulatory motor cortex in speech perception. ...

Infant Auditory Processing and Event-related Brain Oscillations

Infant elaborazione uditiva e oscillazioni cerebrali eventi correlati

Rapid auditory processing and acoustic change detection abilities play a critical role in allowing human infants to efficiently process the fine spectral ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

The Hole Consiglio Modified - Behavior, Cognition e l&#39;interazione sociale in topi e ratti di misura

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Stimolazione del nervo vago come strumento per indurre plasticità Percorsi rilevanti per l&#39;apprendimento Extinction

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to the Unilateral Hemisphere of Rat Brain

Repetitive stimolazione magnetica transcranica al unilaterale emisfero del cervello di ratto

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, ...

Using Eye Movements Recorded in the Visual World Paradigm to Explore the Online Processing of Spoken Language

Utilizzando i movimenti di occhio registrati nel paradigma mondo visivo per esplorare l'elaborazione Online di lingua parlata

In a typical eye tracking study using the visual world paradigm, participants' eye movements to objects or pictures in the visual workspace are recorded ...

An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses

Un Test instrumentato Pull per caratterizzare le prove posturali

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is a common and disabling deficit in Parkinson's disease. To assess postural reflexes, ...

Transcranial Direct Current Stimulation for Online Gamers

Stimolazione transcranica di direct current per i giocatori online

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that applies a weak electric current to the scalp to modulate ...