Name: stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av et stipend fra departementet for økonomi og konkurranseevne (MINECO) av regjeringen i Spania, SAF2016-78898-C2-2-R.

denne studien ble gjennomført i strengt samsvar med både spanske forskrifter (kongelig resolusjon 53/2013 - loven 32/2007) og EU retningslinjer (direktiv 2010/63/EU) på omsorg og bruk av dyr i biomedisinsk forskning.
 1. Forberedelse av rotte Merk: vi har utført eksperimenter i mannlig rotter å unngå hormonelle endringer.
<ol><li>Anesthetize dyr med en miks av ketamin hydroklorid (30 mg/kg) og xylazine hydroklorid (5 mg/kg) Injisert intramuskulært; med denne dose, rotta bør være dypt anesthetized for rundt 1 h.</li>
	<li>Klemme rotta &#39; s tå, fravær av et uttak refleks angir at dyret er helt bevisstløs. Hvis rotta reagerer på klemme, gi supplerende anestesi på en tredjedel av den første dosen.</li>
	<li>Barbere hodebunnen og Desinfiser det kirurgiske området med povidon-jod.</li>
	<li>Plasserer dyrene på en heten pute å vedlikeholde en temperatur på 38 ° C og stabilisere dyret &#39; s leder i en stereotaxic ramme med to øret barer og en bit bar. Vær forsiktig for å unngå piercing trommehinnen i øret stolper.</li>
	<li>Beskytte øynene ved å legge en dråpe ophthalmica gel eller serum saline hvert øye.</li>
</ol> 2. Plasseringen av AC i Temporal benet av rotte <ol><li>ved hjelp av en skalpell, gjøre et snitt langs midtlinjen å avsløre skallen og tilbakekalle periosteum dekker overflaten av kraniet.</li>
	<li>Bruk en steril bomull tips Fjern alle blod dekker overflaten av skallen for å visualisere bregma og lambda interaural 0 etter Paxinos og Watson atlas rotte hjernen 22.</li>
	<li>Gjør et snitt i timelige muskelen nær sin dorsal innsetting på skallen med en skalpell. Trekke muskelen ut med en nål og Sutur materiale, og fikse Sutur materialet stereotactic rammen. Dette vil utsette temporal benet. Hvis blødning oppstår, skyll med kaldt sterilt saltvann.</li>
	<li>Plasserer en steril rett nål i den stereotactic micromanipulator, sørge for at det er sikret.</li>
	<li>Sakte senke nålen før det er rett over overflaten av skallen, slik at spissen av nålen er satt til interaural 0. Sette dette punktet som null, og avgjøre koordinater heretter.</li>
	<li>Avhengig av hjernen området av interesse, variere stereotactic koordinatene. Bestemme koordinatene ved hjelp av Paxinos og Watson atlas rotte hjernen 22. Når koordinatene bestemmes, flytte nålen tilsvarer de koordinatene.</li>
	<li>Mot AC ved hjelp av koordinatene til følgende fire punkter: A: A / P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-8.67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-8.67 mm. lavere nålen høyre over temporal bein å visualisere hver av disse fire poeng. Bruke markør penn, merke punktene på temporal benet og koble dem for å tegne et rektangel; Rektangelet vil fungere som en guide til å åpne et vindu i benet ( figur 1).</li>
</ol> 3. Kirurgisk eksponering av AC <ol><li>Åpne vinduet ved hjelp av en elektrisk drill og en liten drill litt (0,6 mm Ø). Bore omkretsen av rektangelet på 8000 rpm til benet gir bort. Avkjøle boring overflaten av skylling med kaldt sterilt saltvann å hindre skade subkortikal strukturer. Når benet gir måte, kan en nedgang i motstand oppdages. Vær forsiktig så du ikke drille hjernen.</li>
	<li>Om kantlinjene er løs, trekke opp dekker bein med fine tang og lagre den i kaldt sterilt saltvann.</li>
</ol> 4. Ablasjon av AC <ol><li>bruker et kirurgisk mikroskop (10 X), forsiktig kutte meninges med Mikrokirurgiske kniv og fjerne dem ved hjelp av to fine-spiss tang. Hvis blødning oppstår, skyll med kaldt sterilt saltvann.</li>
	<li>Forsiktig Sug opp AC bruker en kirurgisk sugeinnretning (press-0.24 bar) koblet til en steril 20 G butt tupp nål. Dette punktet er viktig og må utføres nøye: Sug opp bare seks kortikale lag og ikke den underliggende hvit substans.</li>
	<li>Sug opp til perforating arteriene stoppe blødninger.</li>
	<li>Når aspirasjon er ferdig, dekker den skadde området med utdraget bein og bruke en absorberbare hemostatic gasbind.</li>
	<li>La timelige muskelen gjenopprette sin opprinnelige posisjon, og deretter Sutur i huden bruker såret klipp (9 mm). Bruke antibiotika sårsalve (se Tabell for materiale). Fortsett å bruke salve på såret to ganger daglig i tre dager. 
	Merk: Hvert program består av et tynt lag på såret.</li>
	<li>Sett inn buprenorfin subcutaneously bak rotta (0,05 mg/kg) som et smertestillende 1t etter operasjonen, og deretter hver 8 h under 72 h.</li>
	<li>Holde dyr på oppvarming pad til den våkner, og returnere den til sin bolig bur gjenopprette.</li>
	<li>Huset dyrene å forhindre bur make berøring sutured området, og gi berikelse elementer. Endre sagmugg daglig for å hindre infeksjon og nøye sjekke at dyret gjenoppretter riktig og ikke viser tegn på ubehag.</li>
</ol> 5. Vev samling Advarsel: ved håndtering av paraformaldehyde (PFA), både solid og vandig, bruk personlig verneutstyr (PVU) og bruke en sikkerhet regjering.
 Merk: forberede 750 mL formaldehyd løsning av oppløsning 4% (w/v) PFA til 1 x fosfat bufret løsning (PBS) ved hjelp av varme (55 ° C). Filtrere formaldehyd løsningen med filter papir. Forberede Ringer &#39; s løsning av oppløsende 8,5 g NaCl, 0,25 g KCl og 0.2 g NaHCO 3 i 1000 mL vann (løsningen pH = 6,9).
<ol><li>La dyret overleve så lenge det er nødvendig for å studere. Når forskning utført med AC ablated rotta er fullført, terminalt anaesthetize det ved intra peritoneal injeksjon av 0,1 mL av natrium pentobarbital (60 mg/kg). Vurdere dybden av anestesi tå knipe og fravær av uttak refleks.</li>
	<li>Når Dyret er dypt anesthetized, utføre en intracardiac perfusjon 23 125 mL Ringer &#39; s løsning etterfulgt av 750 mL formaldehyd løsning ved hjelp av en nål måler 1,8 mm inne diameter.</li>
	<li>Når perfusjonen er ferdig, halshugge rotta på første cervical vertebra.</li>
	<li>Bruk saks å fjerne hud og muskel fra hodet og utsette skallen. Bruk saks til å klippe og åpne foramen magnum og fjerne baksiden av skallen.</li>
	<li>Gjør en tverrgående skjære orbital bein med Spencer saks, og bruk rongeurs å kutt langs øverste kant på skallen for å utsette hjernen. Pass på å ikke skade hjernen.</li>
	<li>Når hjernen er utsatt, forsiktig fjerne den dura mater med fine-spiss tang. Bruk fingeren til å forsiktig scoop under og heve hjernen. Øke hjernen og kutte nerver untIl det er gratis. Fordype hjernen i formaldehyd løsning og lagre den på 4 ° C for 24 h.</li>
</ol> 6. Lokalisering av AC lesjonene <ol><li>etter post fiksering, nøye plassere hjernen i en sagittal rat hjernen matrise utsette lateral overflaten av hjernen.</li>
	<li>Plasserer et kamera 21 cm over cortex overflaten med en kameraet holder, Velg den &#34; super makrofotografering &#34; modus, og ta et bilde av hjernen overflaten.</li>
	<li>Sette hjernen i en koronale rotte hjernen matrise utsette dorsal overflaten av hjernen, og ta et annet bilde.</li>
	<li>Bruker et bilde editor, åpne og skalere dem ned 50% å gjøre det enklere å arbeide med dem. Identifisere bregma, lambda og interaural 0 referanser på bildet etter Paxinos og Watson koordinater 19 og markere deres posisjon i bilder ( figur 2). Tegn konturene av ablation over lateral bildet av hjernen. Beregn omkretsen.</li>
	<li>Import til koordinaten kart hvor den primære (A1) og sekundære områder (Dorsal og ventrale halvdelene) av AC er ligger 18 i filen av editor programmet der du arbeider med bilder. Klikk på kartet og dra det til ovenpå den laterale fotografi av ablated hjernen.
	<ol><li>Gjør bregma og lambda referanser koordinere kartet sammenfaller med bregma og lambda referansene identifisert i bildet av lateral hjernen.</li>
		<li>Bruk rhinal rennen som referanse for å justere bildet av hjernen til kartet, og gjøre dem falle sammen ( figur 2B).</li>
	</ol></li> <li>Beregner prosenten av lesjonen i forhold til området av AC.</li></ol>

<ol>
	<li>Talwar, S. K., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+frequency+discrimination+in+the+white+rat.">Auditory frequency discrimination in the white rat.</a> Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).</li><li>Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogram+of+the+hooded+Norway+rat.">Audiogram of the hooded Norway rat.</a> Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).</li><li>Malmierca, M. S., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+System.">Auditory System.</a> The Rat Nervous System. , 995-1080 (2004).</li><li>Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Auditory+Efferent+System:+New+Insights+from+Cortex+to+Cochlea.">Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea.</a> Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).</li><li>Dinse, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+Case+for+Enrichment.+Focus+on+"Environmental+Enrichment+Improves+Response+Strength,+Threshold,+Selectivity,+and+Latency+of+auditory+cortex+Neurons.".">Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.".</a> J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).</li><li>Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+learning+shapes+the+neural+code+for+stimulus+magnitude+in+primary+auditory+cortex.">Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+Pathways+Determine+Breadth+of+Subthreshold+Frequency+Receptive+Fields+in+Primary+auditory+cortex.">Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex.</a> J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).</li><li>Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mammalian+auditory+cortex+in+the+perception+of+elementary+sound+properties.">Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties.</a> J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).</li><li>Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+synaptic+inhibition+can+create+intensity-tuned+auditory+cortex+neurons.">Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons.</a> Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).</li><li>Le&#243;n, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamam&#233;, C. M., Delano, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortex+basal+activity+modulates+cochlear+responses+in+chinchillas.">Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas.</a> PLOS ONE. 7 (4), e36203 (2012).</li><li>Jager, K., Kossl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticofugal+Modulation+of+DPOAEs+in+Gerbils.">Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils.</a> Hear Res. 332, 61-72 (2016).</li><li>Dragicevic, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Olivocochlear+Reflex+Strength+and+Cochlear+Sensitivity+are+Independently+Modulated+by+auditory+cortex+Microstimulation.">The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).</li><li>Clarkson, C., Herrero-Turri&#243;n, M. J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Auditory+Deafferentation+Induces+Long-Term+Plasticity+in+the+Inferior+Colliculus+of+Adult+Rats:+Microarray+and+qPCR+Analysis.">Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis.</a> Front Neural Circuits. 6, 86 (2012).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#769;an, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regulation+in+calretinin+staining+in+the+rat+inferior+colliculus+after+unilateral+auditory+cortical+ablation.">Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation.</a> J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+down-regulation+of+sound-induced+c-Fos+protein+expression+in+the+inferior+colliculus+after+ablation+of+the+auditory+cortex.">Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex.</a> Front Neuroanat. 4, 141 (2010).</li><li>Hunter, K. P., Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bilateral+lesions+of+auditory+cortex+in+mice+on+the+acoustic+startle+response.">Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response.</a> Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).</li><li>Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+input+and+efferent+activity+regulate+the+expression+of+molecules+involved+in+cochlear+micromechanics.">Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics.</a> Front Syst Neurosci. 8, 253 (2014).</li><li>Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+of+brainstem+electrical+evoked+responses+to+sound+after+restricted+ablation+of+the+auditory+cortex.">Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex.</a> PLOS ONE. 8 (9), e73585 (2013).</li><li>Lamas, V., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+auditory+cortex+results+in+changes+in+the+expression+of+neurotransmission-related+mRNAs+in+the+cochlea.">Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea.</a> Hear Res. 346, 71-80 (2017).</li><li>Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+tonotopic+core+of+rat+auditory+cortex:+physiological+evidence+for+a+posterior+field.">Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field.</a> J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).</li><li>Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+auditory+receptive+field+organization+across+five+cortical+fields+in+the+albino+rat.">Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat.</a> J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2005).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564 (2012).</li></ol>

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av noen kommersielle eller økonomiske relasjoner som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

En vellykket hjernekirurgi hengsler på to faktorer: å holde dyr i live under og etter inngrepet, og nøyaktig finne området av interesse. Sikre at rotta er dypt anesthetized under operasjonen (testing uttak refleks), og får tilstrekkelig analgetika og ikke-ototoxic antibiotika burde hjelpe overlevelse. I tillegg bør rotta holdes på en varmeputen før den reaktiveres bedøvelsen å unngå nedkjøling. Suturing reduseres mottakelighet for infeksjon, og riktig teknikk er viktig: dyr vil plukke på deres sår klipp, så de bør bli implantert stramt nok for å hindre fjerning uten å plassere for mye spenning på såret.
Nøyaktig finne AC (eller andre kortikale område), er det viktig å bestemme plasseringen av bregma og lambda interaural 0 bruke dem som referanser til å beregne grensene for regionen målrettet. Eventuelle feil i beregning av koordinatene vil resultere i den delvise ablation av AC eller uønsket aspirasjon av andre omkringliggende områder. Dermed bør pinne-spissen bare trykk benet på interaural 0, og deretter oversette antero-bakre og medio-lateral koordinatene hva er beskrevet i denne protokollen.
I dette manuskriptet har vi også beskrevet hvordan å kirurgisk avsløre og ablate AC. Det er tre viktige trinn: i boreprosessen, åpning og fjerning av meninges og ablation av aspirasjon. Boring skal utføres på en lav hastighet med minimum press, som en boring høyhastighets genererer varme som kan påvirke i nærheten subkortikal strukturer. Imidlertid bør opprettholde en lav hastighet og kjøling boring området med kaldt sterilt saltvann forhindre skade. I tillegg er minimum trykket viktig å unngå en plutselig brudd i skallen og påfølgende skade på underliggende cortex. Åpning og fjerning av meninges som dekker AC skal utføres nøye for å unngå å bryte blodkar. Hvis blødning oppstår, tidlig og sent prognosen er generelt ugunstige og det er tvilsomt om slike et dyr oppfyller inklusjonskriterier for en pålitelig studie. Vi anbefaler euthanasia i dette tilfellet. Til slutt, aspirasjon (trolig det vanskeligste aspektet i å utføre en effektiv lesjon), må være begrenset til grå materie. Det er to indikatorer som kan bidra til å oppdage tilstedeværelsen av hvit saken: (1) en endring i fargen derimot, som hvite saken er lysere enn den grå saken; og (2) opphør av blødning fra perforating arteriene.
Når manipulasjon utført i hjernen, er det nødvendig å vurdere lokalisering, størrelse og utvidelse av prosedyren i cortex for påfølgende analyse og validering av data fra dyret. I dette manuskriptet detalj vi hvordan å lokalisere ablation utført i cortex bruker kart koordinere tidligere beskrevet av vår gruppe18. Dette kartet ble bygget ved hjelp av omtale fra føljetong delen rekonstruksjoner av histologiske seksjoner, korrelert med Paxinos og Watson atlas rotte hjernen22. Følgelig skiller kartet mellom den primære (A1) og sekundær halvdelene (Dorsal og ventrale) av AC. Den største fordelen med dette koordinere kartet er at det tillater rask lokalisering av lesjonen ved å legge et bilde tatt fra laterale overflaten av hjernen plassert i en sagittal hjernen matrise. En annen fordel er at laboratorier med mindre erfaring i anatomi kan bruke kartet ved å tilpasse den til sine dyr modeller. Det er bare nødvendig å angi avstandene mellom bregma og lambda interaural 0 referanser i en kontroll perfused hjernen og Skaler kartet opp eller ned tilsvarende. Bruk Rhinal rennen som referanse for å justere bildet av hjernen til kartet. Dybden av ablation kan ikke leses i dette koordinere kartet, så det bør fastsettes i hjernen histologiske deler.
Kombinasjonen av stereotactic metoder med kirurgisk eksponering av AC er grunnleggende metoder som lett kan tilpasses av en etterforsker som ønsker å målrette AC i rotte. Dette kan være for et eksperiment for akutt eller som krever implantering av faste enheter. Videre er den kirurgiske ablation av AC tidligere brukt som modell for å studere virkningene av kronisk kortikale deprivasjon i høringen. AC ablations kan også brukes til å studere virkningene som ensidige AC ablations øve i andre kortikale områder eller tjene som en modell av slag. Dermed er eksperimentell design beskrevet her nyttige metoder som kan brukes individuelt eller sammen til et bredt spekter av eksperimentell design.

Rotta er en av de mest brukte dyremodeller i auditiv nevrovitenskap. Robust virkemåten gjør det arbeide for hundrevis av studier per dag. Dens følsomhet og spectral skarphet for hørselshemmede1,2og anatomiske og funksjonelle organiseringen av dens sentrale system, sammenlignes med andre pattedyr3, gjøre rotta en passende dyr modell for å analysere en rekke forskningstema i auditiv nevrovitenskap. Rotte auditiv cortex (AC), spesielt, har vært gjenstand for flere anatomiske og fysiologiske studier som har prøvd å forstå strukturen, organisasjon, og rolle i lydbehandling3. I dag, har AC blitt populært blant nevrologer interesse erfaring-avhengighet plastisitet, auditiv persepsjon, synaptic grunnlaget for mottakelige feltet organisasjon og kortikale kontroll av lydbehandling i den subkortikal auditory kjerner4,5,6,7,8,9. Utfordringene som disse nye tilnærmingsmåtene utgjør, vil prosedyrer som kan finne nøyaktig og kirurgisk utsette AC fremskynde forskningsinnsats. Stereotactic teknikker gjør det enkelt å lokalisere regioner i hjernen uten fysiologi testing. Hjernestørrelse varierer litt mellom dyr, kan hvor alle brain området bestemmes stereotactic koordinater sett fra landemerker på hodeskallen av rotte hjernen.
Den begrensede ablation av AC er kirurgisk fjerning av sensoriske regionen cortex mest direkte knyttet høring. I motsetning til andre metoder brukes til å blokkere aktiviteten til AC, som kjøling eller lokale lidocaine injeksjoner10,11,12, den kirurgiske ablation AC resultatene til kronisk tap av funksjon. Dermed er AC ablations mer egnet for å studere de langsiktige effektene av kortikale deprivasjon og den påfølgende fenomen av lesjon plastisitet. Kombinasjonen av stereotactic metoder med kirurgisk ablations av AC har vært brukt med hell å studere fysiologiske, atferdsmessige og molekylære virkningene av kortikale kontroll deprivasjon13,14,15 ,16,17,18,19. For eksempel er en rotte modell med bilaterale AC ablations brukt til å studere virkningene av kortikale ablasjon i auditiv skremmeeffekt refleks og auditiv hjernestammen svar (ABR)16. Nylig har vi sammenlignet effekten at ensidig versus bilaterale ablations av rotte AC ABR terskler, amplitudes og ventetider på ulike tidspunkt etter skade18. I tillegg har en rotte modell av restriktive AC ablasjon også blitt brukt til å studere effekten av corticofugal sti degenerasjon i de underlegne collicus13,14,15 og de indre øre17 ,19. Etter slik en manipulasjon er utført i hjernen, er det nødvendig å vurdere lokalisering, størrelse og utvidelse av lesjoner i cortex. Selv om det er veldig nyttig, er den viktigste begrensningen av tonotopic kart basert på neuronal svar20,21 elektrofysiologiske teknikker nødvendig å finne auditiv feltene i rotte hjernen. Siden ikke alle laboratorier har nødvendig utstyr og/eller kompetanse til å gjøre slike opptak, bygget vi et koordinere kart basert på overføring av cytoarchitectural grensene av AC til et bilde av hjernens overflaten18. Dette kartet kan være svært nyttig å finne AC uten fysiologi testing.
Nåværende protokollen beskriver en metode for stereotactically guidede plasseringen, kirurgisk eksponering og ablasjon av AC i rotter. Den beskriver også hvordan du bruker våre koordinere kart18 å enkelt lokalisere forlengelse av lesjonen over et bilde av overflaten av ablated hjernen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Ins.</td>
			<td>900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>WILD M650 Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>DAGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor</td>
			<td>W&#38;H elco</td>
			<td>5118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond burr</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>GD021R</td>
			<td>0.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suction device</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>Atmoforte E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td></td>
			<td>30 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Meda</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline serum</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G sterile needle</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>10.331.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Indivior UK</td>
			<td>Buprex</td>
			<td>0.01-0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.120.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spencer scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.804.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical knife</td>
			<td>MSP</td>
			<td>7503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostatic gauze</td>
			<td>Surgicel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saggital rat Brain Matrix</td>
			<td>Activational systems Inc.</td>
			<td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus 5.1 MP</td>
			<td>C-5060 wide zoom</td>
			<td>lens F2.8-4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Reflex 9</td>
			<td></td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canvas 12</td>
			<td>ACD Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 1.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separatory funnel</td>
			<td>labbox</td>
			<td>11409</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

Rotte auditiv cortex (AC) er blitt populært blant auditiv nevrovitenskap etterforskere som er interessert i erfaring-avhengighet plastisitet, auditiv perseptuell prosesser og kortikale kontroll av lyd på subkortikal auditiv kjerner. For å møte nye utfordringer, en prosedyre for å nøyaktig finne og kirurgisk utsett auditiv cortex ville fremskynde dette forskningsinnsats. Stereotactic nevrokirurgi brukes rutinemessig i pre-klinisk forskning i dyremodeller for å engraft en nål eller elektrode et forhåndsdefinert sted i auditiv cortex. I den følgende protokollen bruker vi stereotactic metoder i en ny måte. Vi identifiserer fire koordinere poeng over overflaten av temporal bone av rotte definere et vindu som, når åpnet, nøyaktig viser både primært (A1) og sekundær (Dorsal og ventrale) halvdelene av AC. benytter denne metoden, vi så utføre en kirurgisk ablasjon av AC. Etter slik en manipulasjon er utført, er det nødvendig å vurdere lokalisering, størrelse og utvidelse av lesjoner i cortex. Derfor beskriver vi også en metode for å enkelt finne AC ablasjon postmortem bruker kart koordinere konstruert ved å overføre cytoarchitectural grensene av AC på overflaten av hjernen. Kombinasjonen av stereotactically-guidede plasseringen og ablasjon av AC med lokalisering av skadde området i en koordinere kart postmortem forenkler valideringen av anskaffet fra dyr, og fører til en bedre analyse og forståelse av dataene.

Vi utførte en stereotactically guidede plasseringen, kirurgisk eksponering og ensidig ablasjon av AC i tre Wistar rotter. Lokalisering av lesjonen bekreftet at ablations utført i tre rotter overtatt de store ruter AC (primære, rygg og ventrale halvdelene), og består en rekke 80 til 100% AC området (figur 2B).
Protokollen beskrevet her for å utføre restriktive AC ablations har tidligere blitt brukt i vårt laboratorium for å studere de langsiktige effektene av kortikale kontroll deprivasjon i subkortikal auditiv kjerner og den påfølgende fenomen av plastisitet. I disse studiene, protokollen for AC ablations ble validert ved hjelp av fysiologiske (ABR), atferdsmessige (skremme svar, prepulse hemming; PPT), og molekylær (DNA microarrays qPCR og Western Blot) metoder13,14,15,16,17,18,19. Her for å demonstrere effekten av våre protokollen, vi la tre AC ablated rotter overleve i en uke, og samlet cochleae i samlingen vev skritt å studere endringene i uttrykk for de mest relevante AMPA tenkes i voksen sneglehuset , GluA2 og GluA3, av qPCR. Sammenligningen mellom utskrifter fra AC ablated rotter og humbug kontrollen dyr der alle kirurgi prosessen, men ikke den kortikale ablation ble utført viste en ned-forskrift for GluA2 og en opp-regulering for GluA3 i begge cochleae (Figur 3) , som er med våre tidligere studere19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figur 1: bilder av rotte temporal benet i tre forskjellige kirurgisk trinn. (A) overføring av stereotaxic koordinatene til AC temporal beinet. Koordinatene til de fire punktene er: A: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = +/-8.67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = +/-8.67 mm. (B) koordinatene brukes som referanse til å tegne et rektangel på overflaten av temporal benet som veileder åpningen av et vindu. (C) viser vinduet ble åpnet i benet etter boring. Meninges med blod fartøy kan observeres på overflaten av hjernen. R: rostral, D: dorsal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figur 2: fremgangsmåten for å finne lesjoner i rotte hjernen. (A) fotografi av dorsal overflaten av en AC ablated hjernen med stereotactically implantert nåler i Lambda og Bregma (etter Paxinos og Watson koordinater19). Prikkete markere posisjonen til Bregma og Interaural 0 i 9 cm x 9 cm rutenettet også som dorsal overflaten av hjernen. (B) bilde av lateral overflaten av ablated hjernen lagt til koordinere kartet av AC. Omkretsen av lesjonen er merket med rødt i bildet. Omkretsen av AC området er merket i svart i kartet. I dette eksemplet er prosentandelen av AC ablasjon forhold til det totale området okkupert av AC 84.79%. AC: auditory cortex, IA: inter aural, FR: Rhinal sprekken. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figur 3: endringer i mRNA nivåer av AMPA reseptor underenheter GluA2 og GluA3 etter ensidige AC ablations 7 dager etter lesjon. Resultatene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket for brett endringen. Endringer i GluA2 utskrifter er representert i blått. Endringer i GluA3 utskrifter presenteres i rødt. En betydelig reduksjon i GluA2 og en økning i GluA3 er observert i begge cochleae (ipsi - og kontralateral til ablation) i forhold til falsk kontroller med ingen kortikale ablations på 7 dager etter operasjonen. Dette er i tråd med våre tidligere resultater19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactically-guidede ablasjon rotte auditiv Cortex og lokalisering av lesjon i hjernen

Vi beskriver en metode for stereotactically-guidede plasseringen, eksponering og ablasjon på auditory cortex i rotter. Lokalisering av ablation vurderes ved hjelp av en koordinere kart postmortem.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Stereotaktisk Injeksjon av MikroRNA-uttrykker Lentiviruses til Mouse Hippocampus CA1 Region og vurdering av Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Omfattende analyse av transkripsjon Dynamics fra Brain Samples Etter Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Stimulating the Lip Motor Cortex with Transcranial Magnetic Stimulation

Stimulere Lip Motor Cortex med transkranial magnetisk stimulering

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has proven to be a useful tool in investigating the role of the articulatory motor cortex in speech perception. ...

Infant Auditory Processing and Event-related Brain Oscillations

Infant Auditory Processing og tilstelninger relaterte Brain Svingninger

Rapid auditory processing and acoustic change detection abilities play a critical role in allowing human infants to efficiently process the fine spectral ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Forandringer Hole Board - Måling Behavior, kognisjon og sosialt samspill i mus og rotter

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus nerve stimulering som et verktøy for å indusere plastisitet i Pathways Relevante for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to the Unilateral Hemisphere of Rat Brain

Gjentatte Transkraniell magnetisk stimulering til Ensidig halvkule av Rat Brain

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, ...

Using Eye Movements Recorded in the Visual World Paradigm to Explore the Online Processing of Spoken Language

Øyebevegelser registrert i visuell verden paradigmet å utforske Online behandling av språk

In a typical eye tracking study using the visual world paradigm, participants' eye movements to objects or pictures in the visual workspace are recorded ...

An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses

En instrumenterte Pull-Test for å karakterisere Postural svar

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is a common and disabling deficit in Parkinson's disease. To assess postural reflexes, ...

Transcranial Direct Current Stimulation for Online Gamers

Transkraniell direkte nåværende stimulering for online Gamers

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that applies a weak electric current to the scalp to modulate ...