Name: stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Denna forskning stöddes av ett bidrag från ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (MINECO) av Spaniens regering, SAF2016-78898-C2-2-R.

denna studie utfördes i strikt enlighet med både spanska bestämmelser (Kungliga dekret 53 2013 - lag 32/2007) och Europeiska unionens riktlinjer (direktiv 2010/63/EU) om skötsel och användning av djur i biomedicinsk forskning.
 1. Beredning av råtta Obs: vi utfört experimenten hos hanråttor att undvika hormonella förändringar.
<ol><li>Anesthetize djuret med hjälp av en blandning av ketamin hydroklorid (30 mg/kg) och Xylazinhydroklorid (5 mg/kg) intramuskulärt; med denna dos, råtta bör vara djupt sövd för ca 1 h.</li>
	<li>Nypa råtta &#39; s tå, avsaknad av en tillbakadragande reflexen anger att djuret är helt medvetslös. Om råttan svarar på nypa, ge kompletterande anestesi vid en tredjedel av den initiala dosen.</li>
	<li>Raka hårbotten och desinficera det kirurgiska området med povidonjod.</li>
	<li>Placera djuret på en värmedyna att hålla en temperatur på 38 ° C och stabilisera djuret &#39; s huvud i en stereotaxic ram med två öron barer och en bit bar. Använd försiktighet för att undvika piercing trumhinnan med örat barer.</li>
	<li>Skyddar ögonen genom att tillämpa en droppe oftalmologiska gel eller serum koksaltlösning på varje öga.</li>
</ol> 2. Läge av AC i tinningbenet råttans <ol><li>med en skalpell gör ett snitt längs mittlinjen att exponera skallen och återkalla periostet som täcker ytan av kraniet.</li>
	<li>Använda en steril bomull spets att varsamt ta bort blod som täcker ytan av skallen att visualisera bregma, lambda och interaural 0 enligt Paxinos och Watson atlas av råtta hjärnan 22.</li>
	<li>Gör ett snitt i temporal muskeln nära dess dorsala införande på skallen med en skalpell. Dra i muskeln med hjälp av en nål och sutur material och fixa suturen materialet till den stereotaktiska ramen; Detta kommer att utsätta tinningbenet. Om blödning uppstår, skölj med kallt steril saltlösning.</li>
	<li>Placera en steril rak nål i den stereotaktiska micromanipulator, att se till att det är fullt ut säkrad.</li>
	<li>Sakta sänka nålen tills den är precis ovanför ytan på skallen, så att spetsen på nålen sätts till interaural 0. Detta börvärde som noll och bestämma koordinater från denna punkt.</li>
	<li>Varierar beroende på hjärnan området av intresse, stereotaktisk koordinaterna. Fastställa dessa koordinater genom att utnyttja Paxinos och Watson atlas av råtta hjärnan 22. När koordinaterna bestäms, flytta nålen till matcha dessa koordinater.</li>
	<li>Rikta AC med koordinaterna för följande fyra punkter: A: A / P = -5,8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = +/-8,67 mm. lägre nålen till höger ovanför tinningbenet att visualisera alla dessa fyra punkter. Använda en tuschpenna, markera punkterna på tinningbenet och koppla dem för att rita en rektangel; rektangeln kommer att fungera som en guide till öppna i ett fönster i benet ( figur 1).</li>
</ol> 3. Kirurgisk exponering av AC <ol><li>Öppna fönstret med hjälp av en borrmaskin och en liten borr lite (0,6 mm Ø). Borra omkretsen av rektangeln vid 8000 rpm tills benet ger bort. Cool borrning ytan genom att skölja med kallt steril koksaltlösning att förhindra skador på subkortikala strukturer. När ben ger vika, kan en droppe i motstånd upptäckas. Var noga med att inte borra hjärnan.</li>
	<li>När gränserna är löst, dra upp täckande benet med fin pincett och lagra den i kalla steril saltlösning.</li>
</ol> 4. Ablation av AC <ol><li>med kirurgiska Mikroskop (10 X), försiktigt skär hjärnhinnor med mikrokirurgisk kniv och ta bort dem med två fina spetsiga pincetter. Om blödning uppstår, skölj med kallt steril saltlösning.</li>
	<li>Aspirera försiktigt AC med en kirurgisk suganordning (tryck -0,24 bar) kopplad till en steril kanyl med 20 G trubbig spets. Denna punkt är avgörande och måste utföras mycket noggrant: aspirera endast de sex kortikala skikt och inte den underliggande vita substansen.</li>
	<li>Aspirera tills de perforering artärerna stoppar blödning.</li>
	<li>När ambitionen är klar, täcka det skadade området med extraherade ben och tillämpa en absorberbara hemostatiska gasväv.</li>
	<li>Låt temporal muskeln återhämta sin ursprungliga position, och sedan suturera huden med hjälp av såret klipp (9 mm). Tillämpa antibiotisk salva (se Tabell för material). Fortsätta att tillämpa salva på såret två gånger dagligen i tre dagar. 
	Obs: Varje program består av ett tunt lager appliceras på såret.</li>
	<li>Injicera buprenorfin subkutant på baksidan råtta (0,05 mg/kg) som ett smärtstillande 1 h efter operationen, och sedan varje 8 h under 72 h.</li>
	<li>Hålla djuret på värmedyna tills den vaknar, och returnera den till dess bostäder bur återställa.</li>
	<li>Hus djur individuellt att förhindra bur kompisar från att röra området sys och ger vissa anrikning objekt. Ändra sågspån dagligen för att förhindra infektion och kontrollera noggrant att djuret återhämtar sig ordentligt och inte visar några tecken på obehag.</li>
</ol> 5. Vävnaden samling försiktighet: vid hantering av PARAFORMALDEHYD (PFA), både solid och vattenaktig, Använd personlig skyddsutrustning (PPE) och använda en säkerhet skåp.
 Obs: förbereda 750 mL formaldehydlösning genom upplösning 4% (w/v) PFA in 1 x fosfatbuffrad lösning (PBS) med hjälp av värme (55 ° C). Filtrera formaldehyd lösningen med filterpapper. Förbereda Ringer &#39; s lösning genom att lösa 8.5 g NaCl, 0,25 g KCl och 0,2 g NaHCO 3 i 1 000 mL vatten (lösning pH = 6,9).
<ol><li>Låt djuret överleva för så länge det behövs för studien. När forskningen utförs med AC avlägsnad råttan är klar, obotligt bedöva det genom intra peritoneal injektion av 0,1 mL natrium pentobarbital (60 mg/kg). Bedöma djupet av anestesi genom tå nypa och avsaknad av tillbakadragande reflexen.</li>
	<li>När djuret är djupt sövda, utföra en intrakardiellt perfusion 23 i 125 mL Ringer &#39; s lösning följt av 750 mL formaldehydlösning med hjälp av en nål mätare 1,8 mm i innerdiameter.</li>
	<li>När perfusionen är klar, halshugga råtta vid den första halskotan.</li>
	<li>Använda sax ta bort hud och muskel från huvudet och exponera skallen. Använd sax för att klippa och öppna foramen magnum och ta bort baksidan av skallen.</li>
	<li>Gör en transversala skuren i orbital benet med Spencer sax, och använda rongeurs att skära längs översta kanterna av skallen att exponera hjärnan. Var noga med att inte skada hjärnan.</li>
	<li>När hjärnan är utsatt, ta försiktigt bort dura mater med fina spetsiga pincetter. Använd ett finger för att försiktigt scoop under och lyfta upp hjärnan. Höja hjärnan och skär de nerver untIl är det gratis. Sänk ned hjärnan i formaldehydlösning och lagra den på 4 ° C under 24 h.</li>
</ol> 6. Lokalisering av AC lesioner <ol><li>efter efter fixering, noggrant placera hjärnan i en sagittal råtta hjärnan matris utsätta den laterala ytan av hjärnan.</li>
	<li>Placera en kamera 21 cm ovan cortex ytan med hjälp av en kamera hållare, Välj den &#34; super makro skytte &#34; läge och ta en bild av hjärnan ytan.</li>
	<li>Placera hjärnan i en koronalt råtta hjärnan matris utsätta den dorsala ytan av hjärnan och ta en annan bild.</li>
	<li>Använder ett bildbehandlingsprogram, öppna bilderna och skala dem 50% att göra det lättare att arbeta med dem. Identifiera bregma, lambda och interaural 0 referenser på bilden enligt Paxinos och Watson koordinater 19 och markera sin position i bilder ( figur 2). Rita konturen av ablation över laterala bilden av hjärnan. Beräkna omkretsen.</li>
	<li>Import koordinaten karta där den primära (A1) och sekundära regioner (dorsala och ventrala Cortices) i AC är beläget 18 till fil editor-program där du arbetar med bilder. Klicka på kartan och dra den för att överlagra det laterala fotot av avlägsnad hjärnan.
	<ol><li>Göra bregma och lambda referenser av samordna karta sammanfaller med bregma och lambda referenser anges i bilden av hjärnans laterala.</li>
		<li>Använda den rhinal sprickan som referens för att justera bilden av hjärnan på kartan, och göra dem sammanfaller ( figur 2B).</li>
	</ol></li> <li>Beräkna procentandelen av lesionen i förhållande till den areal som upptas av AC.</li></ol>

<ol>
	<li>Talwar, S. K., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+frequency+discrimination+in+the+white+rat.">Auditory frequency discrimination in the white rat.</a> Hear Res. 126 (1-2), 135-150 (1999).</li><li>Heffner, H. E., Heffner, R. S., Contos, C., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogram+of+the+hooded+Norway+rat.">Audiogram of the hooded Norway rat.</a> Hear Res. 73 (2), 244-247 (1994).</li><li>Malmierca, M. S., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+System.">Auditory System.</a> The Rat Nervous System. , 995-1080 (2004).</li><li>Delano, P. H., Elgoyhen, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Auditory+Efferent+System:+New+Insights+from+Cortex+to+Cochlea.">Editorial: Auditory Efferent System: New Insights from Cortex to Cochlea.</a> Front Syst Neurosci. 10, 1-2 (2016).</li><li>Dinse, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+Case+for+Enrichment.+Focus+on+"Environmental+Enrichment+Improves+Response+Strength,+Threshold,+Selectivity,+and+Latency+of+auditory+cortex+Neurons.".">Sound Case for Enrichment. Focus on "Environmental Enrichment Improves Response Strength, Threshold, Selectivity, and Latency of auditory cortex Neurons.".</a> J Neurophysiol. 92 (1), 36-37 (2004).</li><li>Polley, D. B., Heiser, M. A., Blake, D. T., Schreiner, C. E., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+learning+shapes+the+neural+code+for+stimulus+magnitude+in+primary+auditory+cortex.">Associative learning shapes the neural code for stimulus magnitude in primary auditory cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (46), 16351-16356 (2004).</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+Pathways+Determine+Breadth+of+Subthreshold+Frequency+Receptive+Fields+in+Primary+auditory+cortex.">Intracortical Pathways Determine Breadth of Subthreshold Frequency Receptive Fields in Primary auditory cortex.</a> J Neurophysiol. 91 (6), 2551-2567 (2004).</li><li>Talwar, S. K., Musial, P. G., Gerstein, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mammalian+auditory+cortex+in+the+perception+of+elementary+sound+properties.">Role of mammalian auditory cortex in the perception of elementary sound properties.</a> J Neurophysiol. 85 (6), 2350-2358 (2001).</li><li>Tan, A. Y. Y., Atencio, C. A., Polley, D. B., Merzenich, M. M., Schreiner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbalanced+synaptic+inhibition+can+create+intensity-tuned+auditory+cortex+neurons.">Unbalanced synaptic inhibition can create intensity-tuned auditory cortex neurons.</a> Neuroscience. 146 (1), 449-462 (2007).</li><li>Le&#243;n, A., Elgueda, D., Silva, M. A., Hamam&#233;, C. M., Delano, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+cortex+basal+activity+modulates+cochlear+responses+in+chinchillas.">Auditory cortex basal activity modulates cochlear responses in chinchillas.</a> PLOS ONE. 7 (4), e36203 (2012).</li><li>Jager, K., Kossl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticofugal+Modulation+of+DPOAEs+in+Gerbils.">Corticofugal Modulation of DPOAEs in Gerbils.</a> Hear Res. 332, 61-72 (2016).</li><li>Dragicevic, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Olivocochlear+Reflex+Strength+and+Cochlear+Sensitivity+are+Independently+Modulated+by+auditory+cortex+Microstimulation.">The Olivocochlear Reflex Strength and Cochlear Sensitivity are Independently Modulated by auditory cortex Microstimulation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 16 (2), 223-240 (2015).</li><li>Clarkson, C., Herrero-Turri&#243;n, M. J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Auditory+Deafferentation+Induces+Long-Term+Plasticity+in+the+Inferior+Colliculus+of+Adult+Rats:+Microarray+and+qPCR+Analysis.">Cortical Auditory Deafferentation Induces Long-Term Plasticity in the Inferior Colliculus of Adult Rats: Microarray and qPCR Analysis.</a> Front Neural Circuits. 6, 86 (2012).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#769;an, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+regulation+in+calretinin+staining+in+the+rat+inferior+colliculus+after+unilateral+auditory+cortical+ablation.">Long-term regulation in calretinin staining in the rat inferior colliculus after unilateral auditory cortical ablation.</a> J Comp Neurol. 518, 4261-4276 (2010).</li><li>Clarkson, C., Ju&#237;z, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+down-regulation+of+sound-induced+c-Fos+protein+expression+in+the+inferior+colliculus+after+ablation+of+the+auditory+cortex.">Transient down-regulation of sound-induced c-Fos protein expression in the inferior colliculus after ablation of the auditory cortex.</a> Front Neuroanat. 4, 141 (2010).</li><li>Hunter, K. P., Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bilateral+lesions+of+auditory+cortex+in+mice+on+the+acoustic+startle+response.">Effects of bilateral lesions of auditory cortex in mice on the acoustic startle response.</a> Physiol Behav. 54 (6), 1133-1139 (1993).</li><li>Lamas, V., Arevalo, J. C., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+input+and+efferent+activity+regulate+the+expression+of+molecules+involved+in+cochlear+micromechanics.">Acoustic input and efferent activity regulate the expression of molecules involved in cochlear micromechanics.</a> Front Syst Neurosci. 8, 253 (2014).</li><li>Lamas, V., Alvarado, J. C., Carro, J., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+of+brainstem+electrical+evoked+responses+to+sound+after+restricted+ablation+of+the+auditory+cortex.">Long-term evolution of brainstem electrical evoked responses to sound after restricted ablation of the auditory cortex.</a> PLOS ONE. 8 (9), e73585 (2013).</li><li>Lamas, V., Juiz, J. M., Merch&#225;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+auditory+cortex+results+in+changes+in+the+expression+of+neurotransmission-related+mRNAs+in+the+cochlea.">Ablation of the auditory cortex results in changes in the expression of neurotransmission-related mRNAs in the cochlea.</a> Hear Res. 346, 71-80 (2017).</li><li>Doron, N. N., Ledoux, J. E., Semple, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+tonotopic+core+of+rat+auditory+cortex:+physiological+evidence+for+a+posterior+field.">Redefining the tonotopic core of rat auditory cortex: physiological evidence for a posterior field.</a> J Comp Neurol. 453 (4), 345-360 (2002).</li><li>Polley, D. B., Read, H. L., Storace, D. a., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+auditory+receptive+field+organization+across+five+cortical+fields+in+the+albino+rat.">Multiparametric auditory receptive field organization across five cortical fields in the albino rat.</a> J Neurophysiol. 97 (5), 3621-3638 (2007).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2005).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564 (2012).</li></ol>

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av några kommersiella eller finansiella relationer som kunde tolkas som en potentiell intressekonflikt.

En framgångsrik hjärnoperation gångjärn på två faktorer: att hålla djuret vid liv under och efter ingreppet, och att exakt lokalisera området av intresse. Att säkerställa att råttan är djupt sövd under operationen (provning tillbakadragande reflexen) och får adekvat analgetika och icke-ototoxiska antibiotika bör hjälpa överlevnad. Råtta bör dessutom hållas på en värmedyna tills den vaknar från anestesi att undvika hypotermi. Suturering kommer att minska mottagligheten för infektioner, och rätt teknik är viktigt: djur kommer att plocka på deras sår clips, så de bör planteras tätt nog för att förhindra borttagning utan att lägga för mycket spänning på såret.
Att exakt lokalisera AC (eller något annat kortikala område), är det viktigt att bestämma positionen för bregma, lambda och interaural 0 att använda dem som referenser för att beräkna gränserna för den berörda regionen. Eventuella misstag i beräkningen av koordinaterna kommer att resultera i partiell ablation av AC eller den oönskade aspiration av andra omgivande områden. Således bör nålens spets bara röra benet vid interaural 0, och sedan översätta ryggsköldens och medio-laterala koordinater enligt vad som beskrivs i detta protokoll.
I detta manuskript, har vi också beskrivit hur man kirurgiskt exponera och ablatera AC. Det finns tre viktiga steg: borrning processen, öppnande och borttagning av hjärnhinnorna och ablation av aspiration. Borrning ska utföras vid en låg hastighet med lägsta trycket, som en hög borrning hastighet genererar värme som kan påverka närliggande subkortikala strukturer. Att upprätthålla en låg hastighet och kyla området borrning med kall steril koksaltlösning bör dock hindra skador. Minimitryck är dessutom viktig för att undvika ett plötsligt avbrott av skallen och efterföljande skada underliggande cortex. Öppnande och borttagning av hjärnhinnor som täcker AC bör utföras noggrant för att undvika att bryta blodkärlen. Om blödning uppstår, tidiga och sena prognosen är generellt ogynnsamma och det är tveksamt om sådana djur uppfyller inklusionskriterierna för en tillförlitlig studie. I detta fall rekommenderar vi eutanasi. Slutligen skall aspiration (förmodligen den svåraste aspekten i att utföra en effektiv lesion), begränsas till den grå substans. Det finns två indikatorer som kan hjälpa till att upptäcka förekomsten av den vita substansen: (1) en förändring i kontrasten, som den vita substansen är ljusare än den grå substans; och (2) upphörande av blödning från perforering artärer.
Efter manipuleringen utförs i hjärnan, är det nödvändigt att bedöma den lokalisering, storlek och utvidgningen av förfarandet gjort i cortex för efterföljande analys och validering av data som erhållits från djur. I detta manuskript detalj vi hur man lokalanpassar ablation utförs i cortex använder en samordna karta som tidigare beskrivits av vår grupp18. Denna karta konstruerades med anatomiska referenser från seriell avsnitt rekonstruktioner av histologiska sektioner, korrelerade med Paxinos och Watson atlas av råtta hjärnan22. Följaktligen kartan gör åtskillnad mellan mellan den primära (A1) och sekundära cortices (dorsala och ventrala) av AC. Den största fördelen med denna samordna karta är att det tillåter snabb lokalisering av lesionen av överlagras en bild tagen från den laterala ytan av hjärnan placeras i en sagittal hjärnan matris. En annan fördel är att laboratorier med mindre erfarenhet i anatomi kan använda kartan genom att anpassa det till sina djurmodeller. Det är endast nödvändigt att avstånden mellan bregma, lambda och interaural 0 referenser i en kontroll perfusion hjärna och skala kartan upp eller ner med detta. Använd den Rhinal spricka som referens för att justera bilden av hjärnan till kartan. Djupet av ablation kan inte fastställas i denna samordna karta, så det bör bestämmas i hjärnan histologiska sektioner.
Kombinationen av stereotaktisk metoder med kirurgisk exponering av AC är grundläggande metoder som enkelt kan anpassas av någon utredare som vill rikta AC hos råtta. Detta kan vara för ett akut experiment eller en som kräver implantation av permanenta enheter. Dessutom har Kirurgisk ablation av AC tidigare använts som en modell för att studera effekterna av kronisk kortikala frihetsberövande i förhandlingen. AC ablationer kunde också användas för att studera effekterna som ensidiga AC ablationer utöva andra kortikala områden, eller tjäna som modell för stroke. Således är de experimentella mönster som beskrivs här användbara metoder som kan användas enskilt eller i kombination till ett brett utbud av experimentell design.

Råttan är en av de vanligaste djurmodeller i auditiv neurovetenskap. Robustheten av sitt beteende gör det kunna arbeta för hundratals prövningar per dag. Dess känslighet och spektrala synskärpa för förhandlingen1,2och anatomiska och funktionella organisationen av dess centrala system, jämförbar med andra däggdjur3, gör råttan en lämplig djurmodell för att analysera ett stort antal forskningsområden i auditiv neurovetenskap. Rat hörselbarken (AC), i synnerhet, har varit föremål för flera anatomiska och fysiologiska studier som har försökt att förstå dess struktur, organisation och roll i ljudbehandling3. Numera, har AC blivit populär bland neuroforskare intresserade av erfarenhet-beroende plasticitet, auditiv perception, synaptic grunden för receptiva fältet organisation och kortikala kontrollen av bearbetningen i den subkortikala auditiv atomkärnor4,5,6,7,8,9. För att lösa de utmaningar som dessa nya metoder utgör, kommer att förfaranden som kan exakt lokalisera och kirurgiskt exponera AC påskynda forskningsinsatser. Stereotaktisk teknik gör det enkelt att lokalisera specifika regioner i hjärnan utan fysiologi testning. Även om hjärnan storlek varierar något mellan djur, kan platsen för något hjärnområde bestämmas med hjälp av stereotaktisk koordinater Ställ från sevärdheter på skallen av råtthjärna.
Den begränsade ablationen av AC är kirurgiskt avlägsnande av regionen sensoriska cortex mest direkt relaterade med hörsel. Till skillnad från andra metoder som används för att blockera aktiviteten av AC, såsom kyla eller lokala lidokain injektioner10,11,12, kirurgisk ablation av AC resultaten i kronisk förlust av funktion. Således, AC ablationer är mer lämpade för att studera de långsiktiga effekterna av kortikala deprivation, liksom de efterföljande fenomen av lesion plasticitet. Kombinationen av stereotaktisk metoder med kirurgisk ablationer av AC har använts framgångsrikt att studera fysiologiska, beteendemässiga och molekylära effekterna av kortikala kontrollen deprivation13,14,15 ,16,17,18,19. En råtta modell med bilaterala AC ablationer har exempelvis använts för att studera effekterna av kortikala ablation i auditiv skrämsel reflexen och auditiv hjärnstammen svaren (ABR)16. Nyligen har vi jämfört effekterna det ensidiga kontra bilaterala ablationer av råtta AC producerar i ABR tröskelvärden, amplituder och latenser vid olika tidpunkter efter skada18. Dessutom att en råtta modell av restriktiva AC ablation har också använts för att studera effekten av corticofugal väg degeneration i den sämre collicus13,14,15 och innerörat17 ,19. Efter en sådan manipulation utförs i hjärnan, är det nödvändigt att bedöma den lokalisering, storlek och förlängning av lesioner i cortex. Även om det är mycket användbart, är den största begränsningen av tonotopic kartor baserade på neuronal Svaren20,21 de elektrofysiologiska tekniker som krävs för att lokalisera de auditiva fält i råtthjärna. Eftersom inte alla laboratorier har den nödvändiga utrustningen eller expertis för att göra sådana inspelningar, konstruerade vi en samordna karta baserat på överföring av cytoarchitectural gränserna för AC till en bild av hjärnans yta18. Denna karta kan vara mycket användbart för att hitta AC utan fysiologi testning.
Protokolls beskriver en metod för stereotactically Guidad läge, kirurgisk exponering och ablation av AC hos råttor. Här beskrivs också hur du använder vår samordna karta18 att enkelt lokalisera förlängning av lesionen över en bild på ytan av avlägsnad hjärnor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Ins.</td>
			<td>900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>WILD M650 Heerbrugg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>DAGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental micromotor</td>
			<td>W&#38;H elco</td>
			<td>5118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond burr</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>GD021R</td>
			<td>0.6 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suction device</td>
			<td>Atmos</td>
			<td>Atmoforte E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td></td>
			<td>30 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SM-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Meda</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile saline serum</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20G sterile needle</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture material</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>10.331.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Indivior UK</td>
			<td>Buprex</td>
			<td>0.01-0.05 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.120.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spencer scissor</td>
			<td>dimeda</td>
			<td>08.804.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Lawton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical knife</td>
			<td>MSP</td>
			<td>7503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostatic gauze</td>
			<td>Surgicel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saggital rat Brain Matrix</td>
			<td>Activational systems Inc.</td>
			<td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td></td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Olympus 5.1 MP</td>
			<td>C-5060 wide zoom</td>
			<td>lens F2.8-4.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Reflex 9</td>
			<td></td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canvas 12</td>
			<td>ACD Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>diameter 1.8 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separatory funnel</td>
			<td>labbox</td>
			<td>11409</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA2 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_017261</td>
			<td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Forward</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GluA3 primer Reverse</td>
			<td>GeneBank</td>
			<td>NM_032990</td>
			<td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactically-guided ablation of the rat auditory cortex, and localization of the lesion in the brain

Rat hörselbarken (AC) blir populärt bland auditiv neurovetenskap utredare som är intresserade av erfarenhet-beroende plasticitet, auditiva perceptuella processer och kortikala kontrollen av ljudbearbetning i subkortikala auditiv kärnor. För att möta nya utmaningar, ett förfarande för att exakt lokalisera och kirurgiskt exponera hörselbarken skulle påskynda denna forskningsinsats. Stereotaktisk neurokirurgi används rutinmässigt i prekliniska forskning i djurmodeller för att engraft en nål eller elektrod på en fördefinierad plats inom den auditiva cortexen. I följande protokoll använder vi stereotaktisk metoder på ett nytt sätt. Vi identifierar fyra samordna punkter över ytan av temporal bone av råttan att definiera ett fönster, öppnad exakt utsätter både primärt (A1) och sekundär (dorsala och ventrala) cortices av AC. med denna metod, vi utför sedan ett kirurgiskt ablation av AC. Efter en sådan manipulation utförs, är det nödvändigt att bedöma den lokalisering, storlek och förlängning av lesioner i cortex. Således beskriver vi också en metod för att enkelt hitta den AC ablation postmortem använder kartan samordna konstrueras genom att överföra cytoarchitectural gränserna för AC till ytan av hjärnan. Kombinationen av stereotactically-Guidad läge och ablation av AC med localizationen av det skadade området i en samordna karta postmortem underlättar validering av uppgifter som erhållits från djur, och leder till en bättre analys och förståelse av data.

Vi genomförde en stereotactically Guidad läge, kirurgisk exponering och ensidiga ablation av AC i tre Wistar råttor. Localizationen av lesionen bekräftade att ablationer utförs i tre råttor inkräktat de stora delområdena av AC (primära, dorsala och ventrala cortices) och bestod av en rad 80 till 100% av den totala arealen som AC (figur 2B).
Protokollet beskrivs här för att utföra restriktiva AC ablationer har tidigare använts i vårt laboratorium för att studera de långsiktiga effekterna av kortikala kontrollen frihetsberövande i subkortikala auditiv kärnor, liksom de efterföljande fenomen av plasticitet. I dessa studier protokollet av AC ablationer validerades genom att tillämpa fysiologiska (ABR), beteende (spritta svaren, prepulse hämning; PPI), och molekylär (DNA microarrays, qPCR och Western Blot) metoder13,14,15,16,17,18,19. Här, för att demonstrera effekten av våra protokoll, vi låta de tre AC uppföljningsstudien råttorna överleva i en vecka, och insamlade cochleae under samlingen vävnad steg att studera förändringarna i uttrycket av de mest relevanta AMPA subenheter i vuxen snäckan , GluA2 och GluA3, av qPCR. Jämförelsen mellan avskrifter från AC uppföljningsstudien råttor och sham kontrolldjur där alla kirurgi processen men inte kortikala ablation utfördes visade en down-förordning för GluA2 och en upp-förordning för GluA3 i båda cochleae (figur 3) , som är överens med vår tidigare studie19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figur 1: bilder av råtta tinningbenet på tre olika kirurgiska steg. (A) överföring av AC stereotaxic koordinater till tinningbenet. Koordinaterna för de fyra punkterna är: A: A/P = -5,8 mm, M/L = +/-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = +/-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = +/-8,67 mm. (B) koordinater används som referens för att rita en rektangel på ytan av tinningbenet som guidar öppnandet av ett fönster. (C) visar fönstret öppnas i benet efter borrning. Hjärnhinnorna med blodkärl kan observeras på ytan av hjärnan. R: rostralt, D: dorsala. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figur 2: förfarandet för att lokalisera lesioner i råtthjärna. (A) fotografi av dorsala ytan av en AC avlägsnades hjärnan med stereotactically implanterade nålar i Lambda och Bregma (enligt Paxinos och Watson koordinater19). Streckade linjer markerar positionen för Bregma och Interaural 0 i rutnätet 9 x 9 cm, såväl som i den dorsala ytan av hjärnan. (B) fotografi av den laterala ytan av avlägsnad hjärnan ovanpå att samordna karta över AC. Omkretsen av lesionen är märkt i rött i bilden. Omkretsen av området AC är märkta i svart i kartan. I det här exemplet är procentandelen av AC ablation med avseende på den totala areal som upptas av AC 84.79%. AC: auditiva cortex, IA: inter fonetiska, FR: Rhinal spricka. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figur 3: ändringar i mRNA nivåer av AMPA receptor subenheter GluA2 och GluA3 efter ensidiga AC ablationer 7 dagar efter lesion. Resultaten presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen för vik ändringen. Ändringar för GluA2 avskrifter finns representerade i blått. Ändringar för GluA3 avskrifter presenteras i rött. En signifikant minskning av GluA2 och en ökning av GluA3 observeras i båda cochleae (ipsi - och kontralaterala till ablation) i förhållande till sham kontroller med inga kortikala ablationer på 7 dagar efter operationen; Detta är överens med vårt tidigare resultat19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain at JoVE.com

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

Stereotactically-guidad Ablation av råtta auditiva Cortex och lokalisering av Lesion i hjärnan

Vi beskriver en metod för stereotactically-Guidad läge, exponering och ablation av den auditiva cortexen hos råttor. Localizationen av ablation bedöms med hjälp av en samordna karta efter döden.

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Stereotaktisk injektion av MicroRNA-uttryckande Lentiviruses till musen Hippocampus CA1 Region och bedömning av de Behavioral Utfall

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Omfattande Analys av transkription Dynamics från Brain Prover Efter Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Stimulating the Lip Motor Cortex with Transcranial Magnetic Stimulation

Stimulera Lip Motor Cortex med transkraniell magnetisk stimulering

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has proven to be a useful tool in investigating the role of the articulatory motor cortex in speech perception. ...

Infant Auditory Processing and Event-related Brain Oscillations

Spädbarn ljudbearbetning och evenemang relaterade hjärn Oscillations

Rapid auditory processing and acoustic change detection abilities play a critical role in allowing human infants to efficiently process the fine spectral ...

The Modified Hole Board - Measuring Behavior, Cognition and Social Interaction in Mice and Rats

Den modifierade Hole Board - Mätning Beteende, Kognition och social interaktion i möss och råttor

This protocol describes the modified hole board (mHB), which combines features from a traditional hole board and open field and is designed to measure ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus nerve stimulation som ett verktyg för att inducera plasticitet i vägar som är relevanta för Extinction Lärande

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to the Unilateral Hemisphere of Rat Brain

Repetitiva transkraniell magnetisk stimulering till den ensidiga halvklotet av råtthjärna

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, ...

Using Eye Movements Recorded in the Visual World Paradigm to Explore the Online Processing of Spoken Language

Med ögonrörelser registreras i den visuella värld paradigmen att utforska Online bearbetning av talat språk

In a typical eye tracking study using the visual world paradigm, participants' eye movements to objects or pictures in the visual workspace are recorded ...

An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses

En instrumenterade dragtest att karakterisera Postural Svaren

Impairment of postural reflexes, termed postural instability, is a common and disabling deficit in Parkinson's disease. To assess postural reflexes, ...

Transcranial Direct Current Stimulation for Online Gamers

Transcranial rikta ström stimulering för online-spelare

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive brain stimulation technique that applies a weak electric current to the scalp to modulate ...