Name: overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00
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Ce travail a été financé par le Centre d&#39;excellence en recherche (I-CORE) de la Science Israel Science Foundation (1775/12) et la Fondation scientifique israélienne accorde 1721/16 et 2338/16 (YH) et 825/14 (DK ). Le soutien de Fields Estate Foundation à DK est très apprécié. Ce travail a été réalisé par Ilan Edri et Michal Goldenberg dans l&#39;accomplissement partiel des exigences de thèse MD de la Faculté de médecine de Sackler, Université de Tel Aviv.

1 . Clonage de cis -PT pour surexpression à E. coli <ol><li> Obtenir le vecteur d&#39;expression pET-32b, conçu pour le clonage et l&#39;expression de haut niveau de séquences de protéines fusionnées avec la protéine 17aa thioredoxine (TRX) 17 et la séquence de codage 18 codée par E. codifié E. coli de cis -PT à longueur totale. </li><li> Prenez soin d&#39;avoir un site de clivage TEV-protease (protéine du virus de la gravit...

<ol>
	<li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Prenyltransferase:+New+Insights+into+Protein+Glycosylation,+Rubber+Synthesis,+and+Human+Diseases.">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li><li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyprenyl+diphosphate+synthases.">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li><li>Ogura, K., Koyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Aspects+of+Isoprenoid+Chain+Elongation.">Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation.</a> Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li><li>Imperiali, B., O'Connor, S. 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E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li><li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages.">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li><li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-scale+disruption+of+microorganisms.">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-metal+affinity+chromatography+(IMAC):+a+review.">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li><li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module:+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin.">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li><li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+for+3:1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels.">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457 (2011).</li><li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli.">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li><li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate,+magnesium,+and+triton.">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li><li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium,+isopentenyl+pyrophosphate,+and+farnesyl+thiopyrophosphate:+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis.">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li><li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vision+for+the+future+of+genomics+research.">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).</li><li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+human+glycosylation+disorders:+biochemistry+leads+the+charge.">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li><li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm.">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li><li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems:+current+industrial+applications+and+perspectives.">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21 (2014).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li></ol>

Le protocole décrit ici pour la purification de la DHDDS humaine fonctionnelle dans les cellules de E. coli est simple et efficace, permettant de surexprimer et de purifier la protéine en 3 à 4 jours une fois qu&#39;une construction appropriée est disponible. De tels protocoles pour la purification des protéines sont d&#39;une importance particulière compte tenu des percées dans le séquençage du génome, ce qui a fourni une pléthore d&#39;informations concernant la génétique de nombreuses maladies <...

Les prenyltransférases sont un groupe d&#39;enzymes qui catalysent l&#39;allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l&#39;aide d&#39;isopentényl diphosphate (IPP) via de multiples réactions de condensation 1 , 2 . Z enzymes de type catalysent la formation de doubles liaisons cis à partir de la réaction de condensation, alors que les enzymes de type E catalysent la formation de double liaison trans 3. Les cis- phényltransférases ( cis -PT, enzymes de type Z) sont classiquement classées en fonction de leur longueur de chaîne de produit en chaîne courte (C 15 ), moyenne chaîne (C 50-55 ) et longue chaîne (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) est un cis -PT à chaîne longue eucaryote qui catalyse l&#39;allongement de la chaîne du farnesyl diphosphate (FPP, un diphosphate allylique) par de multiples condensations avec le diphosphate d&#39;isopentényle (IPP) 1, 5 , 6 . Il en résulte la formation de déshydrodolichyl diphosphate, un diphosphate de polyprinyle C 55-100 servant de précurseur pour le dolichylpyrophosphate, la molécule de support de glycosyle impliquée dans la glycosylation 1 de la protéine N. Parmi les juifs ashkénazes, une mutation non conservatrice à l&#39;échec (K42E) dans DHDDS entraîne une rétinite pigmentaire autonome récessive 7 , 8 . Par conséquent, le présent protocole a été développé afin d&#39;acquérir des DHDDS purifiés pour les études mécanistiques. Escherichia coli est considérée comme l&#39;hôte le plus pratique et le plus rentable pour l&#39;expression de protéines recombinantes et est donc également l&#39;hôte le plus utilisé. Cependant, lorsque l&#39;on tente de surexprimer de manière hétérologue les protéines dans E. coli , des considérations spécifiques aux protéines devraient être faites. Obtenir correctement plié, activéE protéines recombinantes d&#39; E. coli , n&#39;est pas une question simple en raison des propriétés distinctes de différentes protéines. De nombreuses approches ont été développées pour surmonter ces obstacles. Ici, l&#39;utilisation de la fusion de protéines, des conditions de culture optimisées et l&#39;optimisation des codons ont été utilisées pour permettre la surexpression et la purification de DHDDS humaines fonctionnellement actives dans E. coli . Il est à noter qu&#39;une tentative précédente de surexpression de la levure de cis -PT sans fusion de protéines a été infructueuse en raison de l&#39;insolubilité complète, même en présence de détergent 12 . Le protocole décrit est simple, rentable, épargnant du temps et permet d&#39;obtenir des préparations DHDDS adaptées aux études mécanistiques. Compte tenu de l&#39;homologie de cis -PT parmi les différentes espèces, nous suggérons que ce protocole puisse être appliqué pour d&#39;autres eucaryotes cis -PT aussi.

<table width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">pET-32b</td>
			<td style="width:100px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69016-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Express&#160;lysY&#160;Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td>C3010I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:365px;height:42px;">cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:100px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TALON-superflow resin</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9574-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiPrep 26/10 desalting column&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiLoad 16/60 superdex-200&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">superdex-200 increase 5/150 GL&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">14C-Isopentenyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Perkin-Elmer</td>
			<td>NEC773050UC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">trans,trans-Farnesyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td>44270-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli

Les prényltransférases (PT) sont un groupe d&#39;enzymes qui catalysent l&#39;allongement de la chaîne du diphosphate allylique à l&#39;aide d&#39;isopentényl diphosphate (IPP) par de multiples réactions de condensation. DHDDS (déshydrodolichyl diphosphate synthase) est une e-eucaryote à longue chaîne cis -PT (formant des doubles liaisons cis de la réaction de condensation) qui catalyse l&#39;allongement de la chaîne du farnesyl diphosphate (FPP, un diphosphate allylique) par de multiples condensations avec le diphosphate d&#39;isopentényle (IPP). DHDDS est d&#39;une importance biomédicale, car une mutation non conservatrice (K42E) dans l&#39;enzyme résulte en une rétinite pigmentaire , entraînant finalement la cécité. Par conséquent, le présent protocole a été développé afin d&#39;acquérir de grandes quantités de DHDDS purifié, adapté aux études mécanistiques. Ici, l&#39;utilisation de la fusion de protéines, des conditions de culture optimisées et l&#39;optimisation des codons ont été utilisées pour permettre la surexpression et la purification de DHDDS humain fonctionnellement actif dans <eM&gt; E. Coli. Le protocole décrit est simple, rentable et temporaire. L&#39;homologie de cis -PT entre différentes espèces suggère que ce protocole peut être appliqué pour d&#39;autres eucaryotes cis -PT aussi bien, comme ceux impliqués dans la synthèse du caoutchouc naturel.

Un aperçu général de la construction utilisée ici et le processus de purification sont illustrés à la figure 1 . Les échantillons obtenus à chaque étape de purification sont représentés sur la figure 2 . Cette analyse SDS-PAGE montre la purification par étapes de DHDDS, ce qui donne un produit hautement purifié. La figure 3 montre les résultats de la SEC analytique de l&#39;enzyme puri...

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Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Un protocole simple pour la surexpression et la purification de la cis- prényltransférase humaine optimisée par codon, dans des conditions non dénaturantes, d&#39; Escherichia Coli , est décrit, avec un dosage d&#39;activité enzymatique. Ce protocole peut être généralisé pour la production d&#39;autres protéines de cis- prenyltransférase en quantité et en qualité adaptées aux études mécanistiques.

La surexpression et la purification de l&#39;être humain<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransférase dans<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

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Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

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