Name: overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00
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Diese Arbeit wurde gefördert durch das Zentrum für Forschungs-Exzellenz der Israelischen Wissenschaftsstiftung (I-CORE) in der Strukturzellbiologie (1775/12) und die Israelische Wissenschaftsstiftung 1721/16 und 2338/16 (YH) und 825/14 (DK ). Die Unterstützung der Fields Estate Foundation an DK wird sehr geschätzt. Diese Arbeit wurde von Ilan Edri und Michal Goldenberg in Teilerfüllung der MD-Thesis-Anforderungen der Sackler Fakultät für Medizin, Tel Aviv Universität durchgeführt.

1 Klonierung von cis- PT zur Überexpression in E. coli <ol><li> Erhalten Sie den pET-32b-Expressionsvektor, der für die Klonierung und die Expression von Proteinsequenzen mit dem 109aa-Thioredoxin (TRX) -Protein 17 und der E. coli- Codon-optimierten 18- kodierenden Sequenz von Volllängen- cis- PT entwickelt wurde. </li><li> Achten Sie darauf, dass eine TEV-Protease (Tabak-Ätzvirus-Protease) -Schnittstelle (ENLYFQ / G, wo &quot;/&qu...

<ol>
	<li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Prenyltransferase:+New+Insights+into+Protein+Glycosylation,+Rubber+Synthesis,+and+Human+Diseases.">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li><li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyprenyl+diphosphate+synthases.">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li><li>Ogura, K., Koyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Aspects+of+Isoprenoid+Chain+Elongation.">Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation.</a> Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li><li>Imperiali, B., O'Connor, S. 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E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li><li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages.">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li><li>Middelberg, A. 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G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+for+3:1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels.">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457 (2011).</li><li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli.">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li><li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium,+isopentenyl+pyrophosphate,+and+farnesyl+thiopyrophosphate:+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis.">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li><li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vision+for+the+future+of+genomics+research.">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).</li><li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+human+glycosylation+disorders:+biochemistry+leads+the+charge.">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li><li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm.">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li><li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems:+current+industrial+applications+and+perspectives.">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21 (2014).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll zur Reinigung von funktionellen humanen DHDDS in E. coli- Zellen ist einfach und effizient, so dass man das Protein in 3 - 4 Tagen überexprimieren und reinigen kann, sobald ein geeignetes Konstrukt vorliegt. Solche Protokolle für die Proteinreinigung sind bei den Durchbrüchen in der Genomsequenzierung von besonderer Bedeutung, die eine Fülle von Informationen über die Genetik vieler Krankheiten 18 lieferte und damit die Entwicklung von Hochdurchsatzme...

Prenyltransferasen sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyl-Diphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen 1 , 2 katalysieren. Z-Typ - Enzyme katalysieren die Bildung von cis - Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion, wohingegen E-Typ - Enzyme 3 trans - Doppelbindungsbildung katalysieren. Cis- Prenyltransferasen ( cis- PT, Z-Typ-Enzyme) werden klassisch nach ihrer Produktkettenlänge in kurzkettige (C 15 ), mittelkettige (C 50-55 ) und langkettige (C 70-120 ) klassifiziert ) 4 . DHDDS (Dehydrodolichyldiphosphatsynthase) ist ein eukaryotisches langkettiges cis- PT, das die Kettenverlängerung von Farnesyldiphosphat (FPP, ein allylisches Diphosphat) über mehrere Kondensationen mit Isopentenyldiphosphat (IPP) 1 katalysiert, 5 , 6 Dies führt zu der Bildung von dehydrodolichyl Diphosphat, ein C 55-100 Polyprenyldiphosphat als Vorstufe für dolichylpyrophosphate dien Molekül des Glycosyl Träger beteiligt in N-verknüpften Proteinglykosylierung 1. Unter den ashkenazischen Juden führt eine nicht-konservative Mutation (K42E) in DHDDS zu einer autosomal-rezessiven Retinitis pigmentosa 7 , 8 . Daher wurde das vorliegende Protokoll entwickelt, um gereinigtes DHDDS für mechanistische Studien zu erwerben. Escherichia coli gilt als der bequemste und kostengünstigste Wirt für die rekombinante Proteinexpression und ist daher auch der am häufigsten verwendete Wirt. Wenn man jedoch versucht, die Proteine ​​in E. coli heterolog zu überexprimieren, sollten proteinspezifische Überlegungen gemacht werden. Gewinnung richtig gefaltet, aktivE rekombinante Proteine ​​aus E. coli , ist aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften verschiedener Proteine ​​keine einfache Sache. Zahlreiche Ansätze wurden entwickelt, um diese Hürden zu überwinden. Hier wurden die Verwendung von Proteinfusion, optimierten Kulturbedingungen und Codonoptimierung verwendet, um die Überexpression und Reinigung von funktionell aktivem humanem DHDDS in E. coli zu ermöglichen . Der vorherige Versuch, die Hefe cis- PT ohne Proteinfusion zu überexprimieren, war aufgrund der vollständigen Unlöslichkeit auch in Gegenwart des Detergens 12 nicht erfolgreich . Das beschriebene Protokoll ist einfach, kostengünstig, zeitsparend und erlaubt es, DHDDS-Präparate zu erhalten, die für mechanistische Studien geeignet sind. Angesichts der Homologie von cis- PT unter verschiedenen Spezies schlagen wir vor, dass dieses Protokoll auch für andere eukaryotische cis- PT angewendet werden kann.

<table width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">pET-32b</td>
			<td style="width:100px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69016-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Express&#160;lysY&#160;Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td>C3010I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:365px;height:42px;">cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:100px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TALON-superflow resin</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9574-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiPrep 26/10 desalting column&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiLoad 16/60 superdex-200&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">superdex-200 increase 5/150 GL&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">14C-Isopentenyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Perkin-Elmer</td>
			<td>NEC773050UC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">trans,trans-Farnesyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td>44270-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli

Prenyltransferasen (PT) sind eine Gruppe von Enzymen, die die Kettenverlängerung von Allyldiphosphat unter Verwendung von Isopentenyldiphosphat (IPP) über mehrere Kondensationsreaktionen katalysieren. DHDDS (Dehydrodolichyldiphosphatsynthase) ist ein eukaryotisches langkettiges cis- PT (bildende cis -Doppelbindungen aus der Kondensationsreaktion), das die Kettenverlängerung von Farnesyldiphosphat (FPP, ein allylisches Diphosphat) über mehrere Kondensationen mit Isopentenyldiphosphat (IPP) katalysiert. DHDDS ist von biomedizinischer Bedeutung, da eine nicht-konservative Mutation (K42E) im Enzym zu Retinitis pigmentosa führt , was letztlich zur Blindheit führt. Daher wurde das vorliegende Protokoll entwickelt, um große Mengen an gereinigtem DHDDS zu erwerben, die für mechanistische Studien geeignet sind. Hier wurden die Verwendung von Proteinfusion, optimierten Kulturbedingungen und Codonoptimierung verwendet, um die Überexpression und Reinigung von funktionell aktivem humanem DHDDS in zu ermöglichen <eM&gt; E Coli Das beschriebene Protokoll ist einfach, kostengünstig und zeitsparend. Die Homologie von cis- PT unter verschiedenen Spezies deutet darauf hin, dass dieses Protokoll auch für andere eukaryotische cis- PT angewendet werden kann, wie jene, die an der Naturkautschsynthese beteiligt sind.

Ein allgemeiner Überblick über das hier verwendete Konstrukt und den Reinigungsprozess sind in Abbildung 1 dargestellt . Die bei jedem Reinigungsschritt erhaltenen Proben sind in Fig. 2 gezeigt . Diese SDS-PAGE-Analyse zeigt die schrittweise Reinigung von DHDDS, was zu einem hochgereinigten Produkt führt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der analytischen SEC des gereinigten Enzyms und zeigt, dass...

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Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Ein einfaches Protokoll zur Überexpression und Reinigung von codonoptimierter, menschlicher cis- Prenyltransferase unter nicht-denaturierenden Bedingungen aus Escherichia Coli , wird zusammen mit einem enzymatischen Aktivitäts-Assay beschrieben. Dieses Protokoll kann für die Produktion von anderen cis- Prenyltransferase- Proteinen in Quantität und Qualität geeignet für mechanistische Studien verallgemeinert werden.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Die Beurteilung Somatische Hypermutation in Ramos B-Zellen nach Überexpression oder Knockdown von spezifischen Genen

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

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Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

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Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

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Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

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Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

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Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...