Name: overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00
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この研究はイスラエル科学財団の構造細胞生物学（I-CORE）のためのセンター（1775/12）およびイスラエル科学財団のグラント1721/16および2338/16（YH）および825/14（DK ）。 DKへのFields Estate Foundationのサポートは高く評価されています。この研究は、テルアビブ大学サックラー医学部のMD卒業要件の部分的な履行においてIlan EdriとMichal Goldenbergが行った。

1。 大腸菌におけるcis- PTの過剰発現のクローニング<ol><li> 109aaチオレドキシン（TRX）タンパク質17と融合したタンパク質配列および完全長cis -PTの大腸菌コドン最適化18コード配列のクローニングおよび高レベル発現のために設計されたpET-32b発現ベクターを得る。 </li><li> シスの上流にTEV-プロテアーゼ（タバコエッチウイ?...

<ol>
	<li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Prenyltransferase:+New+Insights+into+Protein+Glycosylation,+Rubber+Synthesis,+and+Human+Diseases.">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li><li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyprenyl+diphosphate+synthases.">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li><li>Ogura, K., Koyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Aspects+of+Isoprenoid+Chain+Elongation.">Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation.</a> Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li><li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure.">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li><li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis.">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li><li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis.">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li><li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+DHDDS,+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase,+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews.">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li><li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa.">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li><li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages.">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li><li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-scale+disruption+of+microorganisms.">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-metal+affinity+chromatography+(IMAC):+a+review.">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li><li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module:+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin.">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li><li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+for+3:1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels.">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457 (2011).</li><li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli.">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li><li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate,+magnesium,+and+triton.">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li><li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium,+isopentenyl+pyrophosphate,+and+farnesyl+thiopyrophosphate:+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis.">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li><li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vision+for+the+future+of+genomics+research.">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).</li><li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+human+glycosylation+disorders:+biochemistry+leads+the+charge.">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li><li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm.">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li><li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems:+current+industrial+applications+and+perspectives.">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21 (2014).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li></ol>

大腸菌細胞内で機能的ヒトDHDDSを精製するために本明細書に記載されたプロトコールは、簡便かつ効率的であり、適切な構築物が入手できれば3〜4日でタンパク質を過剰発現および精製することができる。タンパク質精製のためのそのようなプロトコールは、多くの疾患18の遺伝学に関する情報の過多を提供するゲノムシーケンシングのブレークスルーを考慮すると特...

プレニルトランスフェラーゼは、複数の縮合反応1 を介して、イソペンテニル二リン酸（IPP）を使用して、アリル二リン酸、2の鎖の伸長を触媒する酵素の一群です。 Z型酵素は、縮合反応からシス二重結合の形成を触媒するが、E型酵素はトランス二重結合形成を触媒する3 。 cis-プレニルトランスフェラーゼ（ シス -PT、Z型酵素）は、その鎖長に応じて、短鎖（C 15 ）、中鎖（C 50-55 ）、および長鎖（C 70-120 ） 4 。 DHDDS（dehydrodolichyl二リン酸シンターゼ）は、イソペンテニル二リン酸（IPP）1と、複数の縮合を介して、ファルネシル二リン酸（FPP、アリル二リン酸）の鎖伸長を触媒する真核生物の長鎖シス -PTあります、5、6。これはdehydrodolichylジホスフェート、dolichylpyrophosphateの前駆体、N結合型タンパク質のグリコシル化に関与する1グリコシル担体分子としてのC 55から100ポリプレニル二リン酸の形成をもたらします。アシュケナージ系ユダヤ人、常染色体劣性網膜色素変性症7,8におけるDHDDS結果におけるミスセンス非保存的変異（K42E）のうち。従って、本プロトコールは、機械的研究に適した精製DHDDSを得るために開発されたものである。 エシェリヒア・コリは、組換えタンパク質発現のための最も便利でコスト効率の良い宿主であると考えられ、従って、最も頻繁に使用される宿主でもある。しかし、 大腸菌でタンパク質を異種的に過剰発現しようとする場合、タンパク質特異的な検討が必要である。正しく折りたたまれた状態で取得する大腸菌由来の組換えタンパク質は、異なるタンパク質の異なる特性のために単純な問題ではない。これらのハードルを克服するための多くのアプローチが開発されている。ここでは、 大腸菌で機能的に活性なヒトDHDDSの過剰発現および精製を可能にするために、タンパク質融合、最適化培養条件およびコドン最適化の使用を使用した。注目すべきは、タンパク質融合なしで酵母cis -PTを過剰発現する以前の試みは、界面活性剤の存在下でさえ完全な不溶性のために成功しなかった12 。記載されたプロトコールは、単純で費用効果が高く、時間を節約し、機械学的研究に適したDHDDS調製物を得ることを可能にする。異なる種間のシス -PTの相同性を考慮すると、このプロトコールは他の真核生物シス -PTにも適用できることを示唆している。

<table width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">pET-32b</td>
			<td style="width:100px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69016-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Express&#160;lysY&#160;Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td>C3010I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:365px;height:42px;">cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:100px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TALON-superflow resin</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9574-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiPrep 26/10 desalting column&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiLoad 16/60 superdex-200&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">superdex-200 increase 5/150 GL&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">14C-Isopentenyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Perkin-Elmer</td>
			<td>NEC773050UC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">trans,trans-Farnesyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td>44270-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli

プレニルトランスフェラーゼ（PT）は、複数の縮合反応によるイソペンテニル二リン酸（IPP） を用いたアリル二リン酸の​​鎖伸長を触媒する酵素群である。 DHDDS（デヒドロドキリチルジホスフェートシンターゼ）は、イソペンテニル二リン酸（IPP）との多重縮合を介してファルネシル二リン酸（FPP、アリル二リン酸）の鎖伸長を触媒する真核生物の長鎖シス -PT（縮合反応からのシス二重結合を形成する）である。 DHDDSは生物医学的に重要であり、酵素中の非保存的突然変異（K42E）が色素性網膜炎をもたらし、最終的には失明に至る。したがって、本プロトコールは、機構的研究に適した精製DHDDSを大量に取得するために開発されたものである。ここでは、機能的に活性なヒトDHDDSの過剰発現および精製を可能にするために、タンパク質融合、最適化培養条件およびコドン最適化の使用を使用した。 <em&gt; Eである。大腸菌。記載されたプロトコルは、単純で、費用効果が高く、時間を節約する。異なる種間のシス -PTの相同性は、このプロトコルが天然ゴム合成に関与するものなどの他の真核性シス -PTにも適用できることを示唆している。

ここで使用したコンストラクトの概要と精製プロセスを図1に示します 。各精製工程で得られた試​​料を図2に示す。このSDS-PAGE分析は、DHDDSの段階的精製を示し、高度に精製された生成物をもたらす。 図3は、精製酵素の分析SECの結果を示し、タンパク質がホモ二量体としての?...

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Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Escherichiaからの非変性条件下でのコドン最適化されたヒトcis-プレニルトランスフェラーゼの過剰発現および精製のための簡単なプロトコール 大腸菌は 、酵素活性アッセイと一緒に、記載されています。このプロトコールは、機構的研究に適した量および質の他のシスプレニルトランスフェラーゼタンパク質の産生のために一般化することができる。

ヒトの過剰発現と精製<em&gt;シス</em&gt; - プレニルトランスフェラーゼ<em&gt;大腸菌</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Research

JoVE Journal

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Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

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Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

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Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

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密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

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Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...