Name: overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo Centro de Excelência em Pesquisa (I-CORE) da Fundação de Ciência da Ciência de Israel (1775/12) e a Fundação de Ciência de Israel concede 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). O apoio da Fields Estate Foundation à DK é altamente apreciado. Este trabalho foi realizado por Ilan Edri e Michal Goldenberg no cumprimento parcial dos requisitos de tese de MD da Faculdade de Medicina de Sackler, Universidade de Tel Aviv.

1. Clonagem de cis -PT para superexpressão em E. coli <ol><li> Se obter o vector de expressão pET-32b, concebidos para a clonagem e expressão de alto nível de sequências de proteínas fundidas com a proteína de 109aa tioredoxina (TRX) 17, e E. coli cod-optimizada 18 sequcia de comprimento completo -PT-cis codificação. </li><li> Tome cuidado para ter um site de clivagem de TEV-protease (proteina de vírus de gravura de tabaco) (...

<ol>
	<li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Prenyltransferase:+New+Insights+into+Protein+Glycosylation,+Rubber+Synthesis,+and+Human+Diseases.">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li><li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyprenyl+diphosphate+synthases.">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li><li>Ogura, K., Koyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Aspects+of+Isoprenoid+Chain+Elongation.">Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation.</a> Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li><li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure.">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li><li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis.">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li><li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis.">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li><li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+DHDDS,+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase,+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews.">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li><li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa.">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li><li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+soluble+His(6)-tagged+TEV+protease.">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li><li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages.">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li><li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-scale+disruption+of+microorganisms.">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li><li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized-metal+affinity+chromatography+(IMAC):+a+review.">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li><li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module:+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin.">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li><li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+for+3:1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels.">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457 (2011).</li><li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli.">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li><li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate,+magnesium,+and+triton.">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li><li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium,+isopentenyl+pyrophosphate,+and+farnesyl+thiopyrophosphate:+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis.">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li><li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vision+for+the+future+of+genomics+research.">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).</li><li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+human+glycosylation+disorders:+biochemistry+leads+the+charge.">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li><li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm.">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li><li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems:+current+industrial+applications+and+perspectives.">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21 (2014).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li></ol>

O protocolo descrito aqui para a purificação de DHDDS humano funcional em células de E. coli é simples e eficiente, permitindo a sobreexpressão e purificação da proteína em 3 a 4 dias, uma vez que uma construção adequada esteja disponível. Tais protocolos para a purificação de proteínas são de especial importância, dado os avanços no seqüenciamento do genoma, que forneceu uma infinidade de informações sobre a genética de muitas doenças 18 , exigindo assim o desenvol...

As preniltransferases são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia de difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação 1 , 2 . As enzimas de tipo Z catalisam a formação de duplas ligações cis da reação de condensação, enquanto as enzimas do tipo E catalisam a formação de ligações duplas trans 3 . cis -Prenyltransferases (cis-PT, enzimas do tipo Z) são classicamente classificados de acordo com o comprimento da cadeia do produto para de cadeia curta (C 15), de cadeia média (C 50-55), e de cadeia longa (C 70-120 ) 4 . DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica que catalisa o alongamento da cadeia do farnesil difosfato (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP) 15 , 6 . Isto resulta na formação de difosfato de dehidrodolilo, um difosfato de poliprenal C 55-100 que serve como precursor de dolichilpirofosfato, a molécula transportadora de glicosil envolvida na glicosilação de proteína 1 ligada a N. Entre os judeus asquenazes, uma mutação não-conservadora de falta de expressão (K42E) em DHDDS resulta em retinite pigmentosa autossômica recessiva 7 , 8 . Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir DHDDS purificado adequado para estudos mecanicistas. Escherichia coli é considerada o hospedeiro mais conveniente e econômico para a expressão da proteína recombinante e, portanto, também é o hospedeiro mais utilizado. No entanto, quando se tenta sobreexpressar heterologicamente proteínas em E. coli , devem ser feitas considerações específicas de proteínas. Obtendo corretamente dobrado, ativadoE proteínas recombinantes de E. coli , não é uma questão simples devido às propriedades distintas de diferentes proteínas. Numerosas abordagens foram desenvolvidas para superar esses obstáculos. Aqui, o uso de fusão protéica, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humano funcionalmente ativo em E. coli . De notar, uma tentativa anterior de sobre-expressar levedura cis -PT sem fusão protéica foi infrutífera devido à insolubilidade completa, mesmo na presença de detergente 12 . O protocolo descrito é simples, econômico, economizando tempo e permite a obtenção de preparações DHDDS adequadas para estudos mecanicistas. Dada a homologia de cis -PT entre diferentes espécies, sugerimos que este protocolo possa ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também.

<table width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">pET-32b</td>
			<td style="width:100px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69016-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Express&#160;lysY&#160;Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td style="width:100px;">NEB</td>
			<td>C3010I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:365px;height:42px;">cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:100px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TALON-superflow resin</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9574-99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiPrep 26/10 desalting column&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HiLoad 16/60 superdex-200&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">superdex-200 increase 5/150 GL&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">14C-Isopentenyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Perkin-Elmer</td>
			<td>NEC773050UC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:365px;height:21px;">trans,trans-Farnesyl pyrophosphate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma</td>
			<td>44270-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpression and purification of human cis-prenyltransferase in escherichia coli

As preniltransferases (PT) são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia do difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação. DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica (formando cis duplas ligações da reação de condensação) que catalisa o alongamento da cadeia do difosfato de farnesilo (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP). DHDDS é de importância biomédica, como uma mutação não-conservadora (K42E) na enzima resulta em retinite pigmentosa , levando finalmente a cegueira. Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir grandes quantidades de DHDDS purificado, adequado para estudos mecanicistas. Aqui, o uso de fusão de proteínas, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humanos funcionalmente ativos em <eM&gt; E. Coli. O protocolo descrito é simples, econômico e economizador de tempo. A homologia de cis -PT entre diferentes espécies sugere que este protocolo pode ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também, como as envolvidas na síntese de borracha natural.

A visão geral da construção usada aqui e o processo de purificação são mostrados na Figura 1 . As amostras obtidas em cada passo de purificação são mostradas na Figura 2 . Esta análise SDS-PAGE mostra a purificação gradual de DHDDS, resultando em um produto altamente purificado. A Figura 3 mostra os resultados da SEC analítica da enzima purificada, revelando que a proteína só é obser...

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Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Um protocolo simples para a superexpressão e purificação da cis -preniltransferase humana, otimizada com codão, em condições não desnaturantes, de Escherichia Coli , é descrito, juntamente com um ensaio de actividade enzimática. Este protocolo pode ser generalizado para a produção de outras proteínas de cis- preniltransferase em quantidade e qualidade adequadas para estudos mecanicistas.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

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