Name: modified roller tube method for precisely localized and repetitive intermittent imaging during long-term culture of brain slices in an enclosed system
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System at JoVE

Verwendung von Tieren folgt genehmigten Zucht und Verwendung von Tieren-Protokolle, die konform zu den Animal Care und verwenden Richtlinien der Colorado State University.
Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur für die langfristige Inkubation und intermittierende Bildgebung des Hippokampus Scheiben. Eine einzige hippocampale Scheibe mit einem speziell präparierten komplexeste Deckgläschen mit einem Plasma Klumpen verbunden ist, und dann die Deckgläsern auf d...

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	<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+a+review.">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+neuronal+circuits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).</li><li>Roo, M. D., Ribic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+structural+plasticity+of+dendritic+spines+in+organotypic+slice+culture.">Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture.</a> Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).</li><li>Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., B&#233;&#299;que, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+synaptic+inputs+drive+dendritic+calcium+amplification+and+cooperative+plasticity+during+clustered+synapse+development.">Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development.</a> Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).</li><li>Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cofilin-actin+rods+in+stressed+hippocampal+slices+and+the+role+of+cdc42+in+amyloid-beta-induced+rods.">Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods.</a> J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).</li><li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+in+form+and+function+of+the+hippocampus+in+rodents,+monkeys,+and+humans.">Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).</li><li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF/cofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function.">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).</li><li>Rahman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+rods+and+aggregates+concur+with+tau+pathology+and+the+development+of+Alzheimer's+disease.">Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).</li><li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+Alzheimer+disease.">Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease.</a> Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).</li><li>He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+use+of+replication-deficient+adenovirus+for+transgene+expression+in+neurons.">Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons.</a> Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).</li><li>K&#252;gler, S., Kilic, E., B&#228;hr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+synapsin+1+gene+promoter+confers+highly+neuron-specific+long-term+transgene+expression+from+an+adenoviral+vector+in+the+adult+rat+brain+depending+on+the+transduced+area.">Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.</a> Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+reporter+for+real-time+imaging+of+cofilin-actin+rods+in+living+neurons.">A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons.</a> PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).</li><li>Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+vectors.">Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.</a> Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).</li><li>Matsushita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+can+be+efficiently+produced+without+helper+virus.">Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus.</a> Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).</li><li>Ward, P., Walsh, C. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).</li><li>Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production+and+purification.">Lentivirus production and purification.</a> Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).</li><li>Huang, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoprocessing+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+miniprecursor+fusions+in+mammalian+cells.">Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells.</a> AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).</li><li>Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibson+assembly:+an+easy+way+to+clone+polyviral+full-length+infectious+cDNA+clones+expressing+an+ectopic+VPg.">Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg.</a> Virol J. 12, 89 (2015).</li><li>Er, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuO:+a+fluorescent+chemical+probe+for+live+neuron+labeling.">NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).</li><li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+actin-ADF/cofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons.">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).</li><li>Cichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+aggregation+blocks+intracellular+trafficking+and+induces+synaptic+loss+in+hippocampal+neurons.">Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons.</a> J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).</li><li>Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis.">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).</li><li>Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase-cleaved+amyloid+precursor+protein+accumulates+at+actin+inclusions+induced+in+neurons+by+stress+or+amyloid+beta:+a+feedforward+mechanisms+for+Alzheimer's+disease.">Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).</li><li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+dimers/trimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation.">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).</li><li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons.">Amyloid-&#946; and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).</li><li>Woo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RanBP9+at+the+intersection+between+cofilin+and+A&#946;+pathologies:+rescue+of+neurodegenerative+changes+by+RanBP9+reduction.">RanBP9 at the intersection between cofilin and A&#946; pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction.</a> Cell Death Disease. , 6 (2015).</li><li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS:+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders.">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li></ol>

Die hier beschriebene Methode der Walze-Röhre ermöglicht langfristige Kultivierung und hochauflösende live Imaging von geschnittenen Hirngewebe. Ein großes Problem mit der Slice-Technik wie hier ist bei der Montage und Wartung von Scheiben. Deckglas Beschichtungen, die Slice-Adhäsion, unterstützen fördern Slice Ausdünnung durch die Stärkung der Auswuchs Neuriten und Wanderung von Zellen aus der Scheibe; wir vermieden die Verwendung dieser Substrate. Das Einfügen von Aminogruppen auf das Glas durch Behandlung mi...

Primärkultur dissoziierten Neuronen aus Regionen des Gehirns Nagetier ist, ein wichtiges Instrument, die von den Forschern verwendet, um Antworten auf pathologisch beobachten reizen beteiligt. Solche Studien haben jedoch den Nachteil Neuronen nur 2D und ohne ihre Glia Support-System zu betrachten. Darüber hinaus unmöglich, es sei denn unter Bedingungen mit sehr hoher Dichte (640 Neuronen/mm2 oder etwa 16 % der Fläche) in dem sie angebaut, zufällige Auswuchs von einem Dendriten und Axon für mehr als eine kurze Strecke von den Zellkörper, hippocampal folgen neuronalen Lebensfähigkeit sinkt über 4 Wochen deutlich1, Begrenzung der Verwendung von dissoziierten Kulturen für erweiterte Studien von altersbedingten Krankheiten. Die Kultivierung von Scheiben aus Nagetier Gehirn vorbereitet, ist eine attraktive Option, die diese Grenzen überwindet durch die Aufrechterhaltung einer organisierten Zellarchitektur und Lebensfähigkeit für Wochen oder Monate. Bedingungen für die Aufrechterhaltung von vielen verschiedener Regionen Nagetier Gehirn im Stück Kultur wurden beschrieben2.
Zwei wichtige Methoden sind am meisten benutzt für langfristige Kultur Gehirnscheiben: Kultivierung auf Membranen in der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle3 oder Kultivierung auf Deckgläsern in versiegelten Röhren um in einem Roller-Inkubator Belüftung4zu drehen durfte. Scheiben-kultivierte auf Membranen können direkt mit hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem aufrechten Mikroskop und Wasser eintauchen Ziele5abgebildet. Alternativ wurden Scheiben kultiviert auf Membranen in Glasschalen unten gute Auflösung von dendritischen Dornen mit einer inversen Mikroskop6erreicht übertragen. Jedoch sind beide Methoden von imaging-Scheiben auf Membranen angebaut offene Systeme, die mittlere Änderungen erfordern und oft Antimykotika und/oder Antibiotika zur Verhinderung oder Reduzierung der Verschmutzung5,6. Scheiben auf einer Membran an der Luft-Medium-Schnittstelle pflegen ausgezeichnete Morphologie und überleben, aber Rückkehr zur genauen Standorte während der sich wiederholenden Bildgebung bei hoher Vergrößerung ist extrem schwierig, es sei denn, das Experiment nur kleine Gruppen von Zellen folgt mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Markers. Obwohl Scheiben gewachsen auf Membranen mit viral-vermittelten Expression von transgenen5,6 verwendet wurden, können biologische Sicherheit Protokolle erfordern eine geschlossene Kultursystem eingesetzt werden, für bestimmte virale Vektoren, die für verwendet werden mit dem Ausdruck Eindringmittel getaggt Proteine und Reporter der Zellphysiologie. Darüber hinaus erfordern eintauchen Ziele Dekontamination zwischen Proben, die in Kultur5folgen werden. Eine wichtige Anwendung der Membran Schnittstelle Kulturen verbindet hochauflösende Bildgebung mit Elektrophysiologie bei Mal Punkte7.
Die Walze Rohr Methode mit Deckgläsern in das Kunststoffrohr lässt keine Elektrophysiologie oder hochauflösende Bildgebung ohne das Deckglas. So wurde diese Methode in den meisten Fällen zu Langzeitstudien angewendet in der Post-Fixierung Beobachtungen8vorgenommen wurden. Hier beschrieben, ist eine Methode, die nutzt die Walze Rohr Kultur Technik aber auf gebohrt-Out Röhren mit Scheiben auf Deckgläsern, die wiederholt können, so lange wie die Kulturen abgebildet werden sind gepflegt. Das geschlossene System erfordert keine mittlere Änderung für die Bildgebung und nutzt komplexeste Deckgläsern treuhändische Marken bieten, die es ermöglichen, imaging bei hoher Vergrößerung, nach Tagen oder Wochen, die präzise Felder vorher abgebildet.
Wir wenden diese Methode, um Änderungen im Nagetier Hippocampus, einer wichtigen Hirnregion beteiligt, Gedächtnis und lernen zu untersuchen. Nagetiere-Hippocampus ist oft untersucht, als Modell für pathologische oder altersbedingten Veränderungen, die während der Entwicklung der kognitiven Beeinträchtigung9, wie n. Chr. auftreten beobachtet. Unsere Methode eignet sich besonders gut für pathologische Veränderungen zu studieren, die innerhalb einer einzigen Scheibe zu im Laufe der Zeit als Reaktion auf Veränderungen der Umwelt, wie z. B. Anstieg der Aβ-Peptide entwickeln, die ist charakteristisch für AD8. Eine Pathologie mit menschlichen und Nagetier AD Gehirn verbunden ist das Vorhandensein von Cofilin-Aktin-Aggregate und Stangen, die letztere mit Bündel von Fäden in denen Cofilin und Aktin sind in einem 1:1 Molverhältnis10,11, 12. Stäbe in festen Scheiben des Ratte Hippocampus nach Aβ-Behandlung, sowie in eine live Nagetier Gehirn-Scheibe mit dem Ausdruck Cofilin-GFP Hypoxie8ausgesetzt eingehalten worden, und sie können zu der synaptischen Dysfunktion gesehen in AD und Schlaganfall. Hier verwenden wir diese neue Methode der Kultivierung der zeitlichen Verlauf und Verteilung in Scheiben zum Ausdruck gebrachten exogene Chimären fluoreszierende Proteine durch verschiedene Viren eingeführt. Wir nutzen dann die neuronale Konkretisierung von Cofilin Reporter Konstrukt, die Entwicklung von Cofilin Stab und aggregierte Pathologie in hippocampal Scheiben in Reaktion auf die Behandlung mit löslichen Aβ Oligomere (Aβo) verfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1536px;" width="1535">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bottoms from 15 cm culture dishes</td>
			<td style="width:220px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:191px;">25384-326</td>
			<td style="width:845px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phillips Head Machine Screws (#10-32)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td>2.5&#34; long and 3/16&#34; in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flat Washers #10</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Machine Screw Nuts (#10-32)</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rubber Grommets&#160;</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td>5/16&#34;, thick; 5/8&#34;, hole diameter; 1.125&#34;, OD</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene tubing (5/16&#34;; OD, 3/16&#34;; ID)</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td>Cut to 1.8&#34; length</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lock Washer #10</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Drill Press, 5 speed&#160;</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>ProTech Model 1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nunclon Delta Flat-Sided Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62407-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm&#160;</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>Diablo freud brand</td>
			<td>Drill bits for cutting plastic.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wood file, 1/4&#34; round</td>
			<td>Ace Harware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spring clips, 16 mm snap holder</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Swivel Head Deburring Tool, 5&#34;</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>26307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal)</td>
			<td style="width:220px;">Grace Bio-Labs</td>
			<td style="width:191px;">666581</td>
			<td>0.5 mm Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 mm hole punch</td>
			<td>Office Max</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm hole punch</td>
			<td>thepunchbunch.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phototeched Coverslips, 12 mm diameter</td>
			<td>Bellco Glass, Inc.</td>
			<td>1916-91012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bunsen Burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Absolute Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nanopure Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-aminopropyltriethoxylane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Double Edge Razor Blades</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28450-182</td>
			<td>Cut into 5.8 cm diameter circles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10501-10</td>
			<td>Cut into 5.8 cm diameter circles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">#21 Surgical Blade</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>25860-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spatula, stainless with tapered end</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gey&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9779&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15023-021</td>
			<td>25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chicken Plasma</td>
			<td>Cocalico Biologicals</td>
			<td>30-0300-5L</td>
			<td>Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 &#176;C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at&#160; -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin, Bovine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-516-01KU</td>
			<td>150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Roller System</td>
			<td>Bellco Biotech</td>
			<td>SciERA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Roller Incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Model 3956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N21-MAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AR008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200 mM Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15023-021</td>
			<td>25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10888-022&#160;</td>
			<td>Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Third generation lentivirus packaging</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4975-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">159 K cutoff centrifugal filters (Centricon)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lentiviral cloning system (InFusion)</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmids 30323, 50856, 51279</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neuronal cell viability dye (NeuO)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>1801</td>
			<td>Thaw once and quick freeze in 4 &#181;L aliquots. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>air: 4X, 20; oil: 40X, 60X,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disc confocal system</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope EMCCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Cascade II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope lasers and integration</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human Plasmin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1867</td>
			<td>0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified roller tube method for precisely localized and repetitive intermittent imaging during long-term culture of brain slices in an enclosed system

Kultivierte Nagetier Gehirnscheiben eignen sich für die Erforschung der zellulären und molekularen Verhaltens der Neuronen und Glia in einer Umgebung, die viele ihrer normalen in-Vivo -Interaktionen unterhält. Scheiben aus unterschiedlichsten transgene Mauslinien oder Verwendung von viralen Vektoren für Ausdruck von Eindringmittel tagged Proteinen oder Reporter in Wildtyp Gehirnscheiben gewonnen ermöglichen hochauflösende Bildgebung durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Obwohl verschiedene Methoden entwickelt worden sind, für imaging Gehirnscheiben kombiniert Stück Kultur mit der Fähigkeit zu führen hat sich wiederholende hochauflösende Bildgebung bestimmter Zellen in live Scheiben über längere Zeit Probleme aufgeworfen. Dies gilt insbesondere, wenn virale Vektoren für Expression exogene Proteine verwendet werden, da dies am besten geschieht in einem geschlossenen System zum Schutz der Nutzer und Kreuzkontamination zu verhindern. Einfache Änderungen an der Walze Rohr Gehirn Stück Kultur-Methode, die für sich wiederholende hochauflösende Bildgebung von Scheiben über viele Wochen in einem geschlossenen System zu ermöglichen, werden gemeldet. Kultivierung der Scheiben auf komplexeste Deckgläsern erlaubt die Verwendung von treuhändische Markierungen schnell und genau die Bühne, um das gleiche Feld im Laufe der Zeit vor und nach verschiedenen Behandlungen Bild neu positionieren. Beispiele sind für den Einsatz dieser Methode kombiniert mit spezifischen neuronalen Färbung und Ausdruck, Änderungen in der hippocampal Stück Architektur zu beobachten, viral-vermittelte neuronale Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen und die Entwicklung von Cofilin Pathologie dargestellt, die zuvor im Hippocampus der Alzheimer-Krankheit (AD) in Reaktion auf die Scheibe Behandlung mit Oligomere von Amyloid-β (Aβ) Peptid beobachtet wurde.

Um festzustellen, wie genau so Markierungen können genutzt werden, um die gleichen Zellen in den gleichen Bereichen im Laufe der Zeit Reimaging, untersuchten wir Scheiben auf komplexeste Deckgläsern(Abbildung 6)angebaut. Neuronen wurden visualisiert durch Färbung mit einem vital-Farbstoff (100 nM für 2 h; nicht-neuronalen Zellen keine Flecken), die verschwindet aus Neuronen im Laufe der Zeit ohne Schädigung der Zellen-2...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System at JoVE

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Hier ist eine modifizierte Roller Schlauch Methode zur Kultivierung und intermittierende hochauflösende Bildgebung des Gehirns Nagetier Scheiben über viele Wochen mit präzisen Neupositionierung auf komplexeste Deckgläsern. Neuronalen Lebensfähigkeit und Slice Morphologie sind gut gepflegt. Anwendungen dieses komplett geschlossenes System mit Viren für Zelltyp spezifische Ausdruck stehen zur Verfügung.

Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

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A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

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In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

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Regioselektive Biolistic Targeting in Organotypische Hirnschnitten mit modifizierter Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

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Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

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Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...