Name: modified roller tube method for precisely localized and repetitive intermittent imaging during long-term culture of brain slices in an enclosed system
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System at JoVE

Uso de animales sigue cría aprobado y protocolos de uso de animales que se ajusten al cuidado Animal y utilizar las pautas de la Universidad Estatal de Colorado.
Nota: El protocolo a continuación describe el método de preparación y cultura para la incubación a largo plazo y la proyección de imagen intermitente de rebanadas hippocampal. Una sola rebanada hippocampal se une a un cubreobjetos photoetched especialmente preparado con un coágulo de plasma, y luego el cubreobjetos se sellan en...

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	<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+a+review.">Organotypic brain slice cultures: a review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+neuronal+circuits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).</li><li>Roo, M. D., Ribic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+structural+plasticity+of+dendritic+spines+in+organotypic+slice+culture.">Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture.</a> Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).</li><li>Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., B&#233;&#299;que, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+synaptic+inputs+drive+dendritic+calcium+amplification+and+cooperative+plasticity+during+clustered+synapse+development.">Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development.</a> Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).</li><li>Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cofilin-actin+rods+in+stressed+hippocampal+slices+and+the+role+of+cdc42+in+amyloid-beta-induced+rods.">Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods.</a> J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).</li><li>Clark, R. E., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+in+form+and+function+of+the+hippocampus+in+rodents,+monkeys,+and+humans.">Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).</li><li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF/cofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function.">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).</li><li>Rahman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+rods+and+aggregates+concur+with+tau+pathology+and+the+development+of+Alzheimer's+disease.">Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).</li><li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+Alzheimer+disease.">Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease.</a> Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).</li><li>He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li><li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+use+of+replication-deficient+adenovirus+for+transgene+expression+in+neurons.">Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons.</a> Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).</li><li>K&#252;gler, S., Kilic, E., B&#228;hr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+synapsin+1+gene+promoter+confers+highly+neuron-specific+long-term+transgene+expression+from+an+adenoviral+vector+in+the+adult+rat+brain+depending+on+the+transduced+area.">Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area.</a> Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+reporter+for+real-time+imaging+of+cofilin-actin+rods+in+living+neurons.">A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons.</a> PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).</li><li>Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+vectors.">Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.</a> Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).</li><li>Matsushita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+can+be+efficiently+produced+without+helper+virus.">Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus.</a> Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).</li><li>Ward, P., Walsh, C. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).</li><li>Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production+and+purification.">Lentivirus production and purification.</a> Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).</li><li>Huang, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoprocessing+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+miniprecursor+fusions+in+mammalian+cells.">Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells.</a> AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).</li><li>Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibson+assembly:+an+easy+way+to+clone+polyviral+full-length+infectious+cDNA+clones+expressing+an+ectopic+VPg.">Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg.</a> Virol J. 12, 89 (2015).</li><li>Er, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuO:+a+fluorescent+chemical+probe+for+live+neuron+labeling.">NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).</li><li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+actin-ADF/cofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons.">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).</li><li>Cichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+aggregation+blocks+intracellular+trafficking+and+induces+synaptic+loss+in+hippocampal+neurons.">Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons.</a> J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).</li><li>Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis.">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).</li><li>Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase-cleaved+amyloid+precursor+protein+accumulates+at+actin+inclusions+induced+in+neurons+by+stress+or+amyloid+beta:+a+feedforward+mechanisms+for+Alzheimer's+disease.">Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).</li><li>Davis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+dimers/trimers+potently+induce+cofilin-actin+rods+that+are+inhibited+by+maintaining+cofilin+phosphorylation.">Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation.</a> Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).</li><li>Walsh, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+and+proinflammatory+cytokines+utilize+a+prion+protein-dependent+pathway+to+activate+NADPH+oxidase+and+induce+cofilin-actin+rods+in+hippocampal+neurons.">Amyloid-&#946; and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons.</a> PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).</li><li>Woo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RanBP9+at+the+intersection+between+cofilin+and+A&#946;+pathologies:+rescue+of+neurodegenerative+changes+by+RanBP9+reduction.">RanBP9 at the intersection between cofilin and A&#946; pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction.</a> Cell Death Disease. , 6 (2015).</li><li>Shaw, A. E., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+regulation+of+cofilin+activity+in+the+CNS:+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+multiple+neurological+disorders.">Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders.</a> Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).</li></ol>

El método de tubo de rodillo que se describe aquí permite el cultivo a largo plazo y la proyección de imagen en alta resolución del tejido de cerebro en rodajas. Un problema importante con la técnica de corte aplicado aquí es en el montaje y mantenimiento de las rebanadas. Recubrimientos de cubreobjetos que apoyan la adhesión de la rebanada, promover la rebanada adelgazamiento por aumento de la extensión de neuritas y la migración de las células de la rodaja; así, evitamos la utilización de estos sustratos. L...

Cultivo primario de neuronas disociadas de las regiones del cerebro de roedor es un instrumento importante utilizado por los investigadores para observar respuestas a patológico implicado estímulos. Sin embargo, estos estudios tienen la desventaja de mirar las neuronas en 2D solo y sin su sistema de soporte de glial. Además, a menos que se cultivan bajo condiciones de muy alta densidad (640 neuronas/mm2 o cerca de 16% de la superficie) en el cual se convierte en imposible seguir un resultado aleatorio de una dendrita o un axón para más que una corta distancia del cuerpo celular hipocampal viabilidad neuronal durante 4 semanas LTO1, limitar el uso de culturas disociadas estudios extendidos de patologías relacionadas con la edad. El cultivo de las rebanadas de cerebro de roedor es una opción atractiva que supera estas limitaciones al mantener una arquitectura celular organizado y viabilidad durante semanas o meses. Condiciones para el mantenimiento de diferentes regiones del cerebro de roedor en sector cultura han sido descritas2.
Dos métodos principales son ampliamente utilizados para el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro: permite para girar en un incubador de rodillo para proporcionar aireación4cultivo de membranas en la interfaz aire-líquido3 o cultivo en cubreobjetos en tubos cerrados. Sectores cultivados en las membranas pueden ser directamente reflejadas con microscopía de fluorescencia de alta resolución usando un microscopio vertical y de objetivos de inmersión de agua5. Por otra parte, sectores cultivados en las membranas han sido transferidos a platos de fondo de vidrio para lograr la buena resolución de espinas dendríticas usando un microscopio invertido6. Sin embargo, ambos métodos de rebanadas en las membranas de la proyección de imagen son sistemas abiertos que requieren cambios medianas y suelen utilizan antifúngicos o antibióticos para prevenir o reducir la contaminación5,6. Rodajas en una membrana en la interfase medio aire mantienen excelente morfología y supervivencia, pero volviendo a lugares precisos en imágenes repetitivas a alta magnificación es extremadamente difícil a menos que el experimento sigue sólo pequeños grupos de células expresan un marcador fluorescente. Aunque se han utilizado láminas en membranas con viral mediada por la expresión de los transgenes5,6, protocolos de bioseguridad pueden requerir un sistema de cultivo cerrado se emplea para ciertos vectores virales que se utilizan para expresión de fluorescencia con la etiqueta proteínas y reporteros de fisiología de la célula. Además, objetivos de inmersión requieren descontaminación entre las muestras que se seguirá en la cultura5. Una aplicación importante de las culturas de interfaz de membrana es la combinación de imágenes de alta resolución con electrofisiología en vez puntos7.
El método de tubo de rodillo con cubreobjetos dentro del tubo plástico no permite cualquier electrofisiología o la proyección de imagen de alta resolución sin quitar el cubreobjetos. Por lo tanto, este método se ha aplicado más a menudo posible a los estudios a largo plazo en el que se han hecho observaciones posteriores a la fijación8. Se describe aquí es un método que utiliza la técnica de cultivo de tubo de rodillo pero en tubos perforados hacia fuera con rodajas en cubre-objetos que pueden ser reflejada repetidamente durante el tiempo que las culturas se mantiene. El sistema cerrado no requiere ningún cambio medio para la proyección de imagen y utiliza photoetched cubreobjetos para proporcionar marcas fiduciales que permiten la proyección de imagen a gran aumento, después de días o semanas, los precisos campos anteriormente reflejados.
Aplicamos este método para examinar los cambios en el hipocampo de roedor, una región del cerebro importante en la memoria y el aprendizaje. El hipocampo de roedor a menudo se estudia como modelo para patológicas o relacionadas con la edad cambios observados durante el desarrollo de deterioro cognitivo9, como las que ocurren en AD. Nuestro método está particularmente bien adaptado para el estudio de los cambios patológicos que se desarrollan dentro de una sola rebanada con el tiempo en respuesta a cambios ambientales, tales como aumento de péptidos Aβ, que es característico de AD8. Una patología asociada con cerebro humano y roedor AD es la presencia de agregados de actina cofilin y varillas, los paquetes que contiene éste de filamentos de actina y cofilin están en una relación molar 1:110,11, 12. las barras se han observado en fijadas rebanadas de hipocampo de rata después del tratamiento de Aβ, así como dentro de un trozo de cerebro de roedor vivo expresando cofilin-GFP sometido a hipoxia8, y pueden contribuir a la disfunción sináptica en AD y accidente cerebrovascular. Aquí utilizamos este nuevo método de cultivo para observar la evolución temporal y distribución dentro de rebanadas de expresadas proteínas fluorescentes quiméricas exógenas introducidas por virus diferentes. Luego utilizamos la expresión específica neuronal de una construcción de reportero cofilin para seguir el desarrollo de la barra de cofilin y patología agregada en rebanadas hippocampal en respuesta al tratamiento con oligómeros de Aß soluble (Aβo).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1536px;" width="1535">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bottoms from 15 cm culture dishes</td>
			<td style="width:220px;">VWR Scientific</td>
			<td style="width:191px;">25384-326</td>
			<td style="width:845px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phillips Head Machine Screws (#10-32)</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td>2.5&#34; long and 3/16&#34; in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flat Washers #10</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Machine Screw Nuts (#10-32)</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rubber Grommets&#160;</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td>5/16&#34;, thick; 5/8&#34;, hole diameter; 1.125&#34;, OD</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene tubing (5/16&#34;; OD, 3/16&#34;; ID)</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td>Cut to 1.8&#34; length</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lock Washer #10</td>
			<td>ACE Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Drill Press, 5 speed&#160;</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>ProTech Model 1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nunclon Delta Flat-Sided Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62407-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm&#160;</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>Diablo freud brand</td>
			<td>Drill bits for cutting plastic.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Wood file, 1/4&#34; round</td>
			<td>Ace Harware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spring clips, 16 mm snap holder</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Swivel Head Deburring Tool, 5&#34;</td>
			<td>Ace Hardware</td>
			<td>26307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal)</td>
			<td style="width:220px;">Grace Bio-Labs</td>
			<td style="width:191px;">666581</td>
			<td>0.5 mm Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6 mm hole punch</td>
			<td>Office Max</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm hole punch</td>
			<td>thepunchbunch.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phototeched Coverslips, 12 mm diameter</td>
			<td>Bellco Glass, Inc.</td>
			<td>1916-91012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bunsen Burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Absolute Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nanopure Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-aminopropyltriethoxylane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Double Edge Razor Blades</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28450-182</td>
			<td>Cut into 5.8 cm diameter circles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>10501-10</td>
			<td>Cut into 5.8 cm diameter circles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">#21 Surgical Blade</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>25860-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spatula, stainless with tapered end</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gey&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9779&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">&#160;Glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15023-021</td>
			<td>25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chicken Plasma</td>
			<td>Cocalico Biologicals</td>
			<td>30-0300-5L</td>
			<td>Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 &#176;C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at&#160; -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thrombin, Bovine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-516-01KU</td>
			<td>150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Roller System</td>
			<td>Bellco Biotech</td>
			<td>SciERA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Roller Incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Model 3956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N21-MAX</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AR008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200 mM Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15023-021</td>
			<td>25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10888-022&#160;</td>
			<td>Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Third generation lentivirus packaging</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4975-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">159 K cutoff centrifugal filters (Centricon)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lentiviral cloning system (InFusion)</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmids 30323, 50856, 51279</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neuronal cell viability dye (NeuO)</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td>1801</td>
			<td>Thaw once and quick freeze in 4 &#181;L aliquots. Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>air: 4X, 20; oil: 40X, 60X,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spinning disc confocal system</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope EMCCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Cascade II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope lasers and integration</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEK293T cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human Plasmin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1867</td>
			<td>0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified roller tube method for precisely localized and repetitive intermittent imaging during long-term culture of brain slices in an enclosed system

Rebanadas de cerebro de roedor cultivadas son útiles para estudiar el comportamiento celular y molecular de las neuronas y glia en un entorno que mantiene muchas de sus interacciones normales en vivo . Rebanadas de una variedad de líneas de ratón transgénico o el uso de vectores virales para la expresión de proteínas fluorescencia etiquetas o reporteros en rebanadas de cerebro de tipo salvaje permiten proyección de imagen de alta resolución por microscopía de fluorescencia. Aunque se han desarrollado varios métodos para rebanadas de cerebro, combinando cultura rebanada con la capacidad para realizar la proyección de imagen repetitiva imagen alta resolución de células específicas en rebanadas vivo durante largos períodos de tiempo ha planteado problemas. Esto es especialmente cierto cuando los vectores virales se utilizan para la expresión de proteínas exógenas, puesto que esto se hace mejor en un sistema cerrado para proteger a los usuarios y evitar la contaminación cruzada. Simples modificaciones al método de cultivo rodaja rodillo tubo cerebro que permiten la repetitiva imagen de alta resolución de rebanadas durante muchas semanas en un sistema cerrado se divulgan. Rodajas en photoetched cubreobjetos de cultivo permite el uso de marcas fiduciales a rápidamente y exactamente colocar el escenario para el campo idéntico de la imagen en el tiempo antes y después de diferentes tratamientos. Se muestran ejemplos para el uso de este método combinado con tinción neuronal específica y expresión en hipocampo slice arquitectura viral mediada por la expresión neuronal de proteínas fluorescentes y el desarrollo de la patología de cofilin, que previamente se observó en el hipocampo de la enfermedad de Alzheimer (AD) en respuesta al tratamiento de la rebanada con oligómeros del péptido amiloide-β (Aβ).

Para determinar la precisión con marcas fiduciales pueden utilizarse para crear una nueva imagen de las mismas células dentro de los mismos campos con el tiempo, examinamos rebanadas en photoetched cubreobjetos (figura 6A). Las neuronas se visualizaron mediante tinción con un colorante vital (100 nM para 2 h; no se mancha las células no neuronales), que desaparece de las neuronas con el tiempo sin dañar las células25</...

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Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

Presentado aquí es un método de tubo de rodillo modificado para cultivo e intermitente proyección de imagen de alta resolución del cerebro de roedor rodajas durante muchas semanas con reposicionamiento preciso en photoetched cubreobjetos. Viabilidad neuronal y la morfología de la rebanada se mantienen bien. Se proporcionan aplicaciones de este sistema totalmente cerrado con virus para la expresión específica de tipo celular.

Método de tubo de rodillo modificado precisamente localizada y repetitiva imagen intermitente durante el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro en un sistema cerrado

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Investigación

Neurociencias

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Regioselectiva biolística Focalización en Organotípicos cerebro rebanadas Usando una pistola de genes Modificado

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...