Name: measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2017-10-05T15:00:00
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Este estudo foi suportado pela bolsa de investigação intramural Instituto de Coreia da ciência e tecnologia (2E27513) e o elevado valor acrescentado alimentos tecnologia desenvolvimento programa (IPET) financiado pelo Ministério de agricultura, alimentação e Assuntos rurais (315067-03).

Nota: todo o experimento deve ser realizado em um laboratório isolado limpo a 20 ° C, com a poeira baixa e com a minimização da contaminação durante o worm e manipulação bacteriana. Para essa finalidade, devem ser realizados experimentos sob a chama de uma lâmpada de álcool ou usando uma bancada limpa.
 1. manutenção de c. elegans e ovo de preparação para o teste químico <ol><li>manutenção c. elegans N2 (var. Bristol) sobre uma placa de ágar NGM alimentad...

<ol>
	<li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+strategies+for+drug+discovery:+present+and+future.">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li><li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals:+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+(REACH).">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).</li><li>Honnen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+powerful+alternative+model+organism+to+promote+research+in+genetic+toxicology+and+biomedicine.">Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine.</a> Arch. Toxicol. , (2017).</li><li>Hunt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+model+in+toxicity+testing.">The C. elegans model in toxicity testing.</a> J. Appl. 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Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorooctane+sulfonate+exposure+causes+gonadal+developmental+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans+through+ROS-induced+DNA+damage.">Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage.</a> Chemosphere. 155, 115-126 (2016).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+screening+platform+for+the+rapid+assessment+of+chemical+disruption+of+germline+function.">A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function.</a> Environ. 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Plant Sci. 7, 1667 (2016).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+topoisomerase+inhibitor,+daurinol,+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide.">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).</li><li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice.">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563 (2014).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).</li><li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation.">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).</li><li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening:+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities.">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li></ol>

Neste artigo, descrevemos a avaliação da toxicidade de produtos químicos em c. elegans, um nematódeo de solo, usando etoposide como um exemplo tóxica. Para este fim, usamos duas condições experimentais. No primeiro set, c. elegans foram cultivadas na etoposide contendo placas de ovos para a fase de adulta jovem, e então os vermes foram autorizados a colocar ovos em placas NGM normais sem produtos químicos. No segundo conjunto experimental, c. elegans continuamente foram tratados com et...

Avaliação toxicológica é essencial para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, nutracêuticos e cosmecêuticos, bem como a avaliação de risco de várias toxinas ambientais. O modelo de roedor é um dos mais populares na vivo sistemas experimentais para o estudo de toxicologia; Alternativamente, organismos não-mamíferos, tais como c. elegans são também amplamente utilizados. Modelos de avaliação toxicológica mamiferas são benéficos devido não só animais questões éticas, mas também sua conveniência e utilidade, considerando a relação custo-eficácia, facilidade de manutenção, velocidade e reprodutibilidade1,2 ,3,4.
C. elegans, um solo redonda worm, tem sido explorada como um animal modelo em várias pesquisas básicas e aplicadas biologia e química. É um 1 mm de comprimento, o nematódeo transparente, que é simplesmente mantido em sólido ou líquido nematódeo crescimento Media (NGM) alimentados com a estirpe bacteriana Escherichia coli OP50. C. elegans tem um ciclo de vida curto, e o selvagem-tipo N2 c. elegans põe aproximadamente 300 ovos. Portanto, ela é facilmente propagada para serem utilizados como materiais experimentais3,4,5. C. elegans também tem sido amplamente utilizada nos estudos toxicológicos de muitas drogas e poluentes ambientais6,7,8,9.
Porque muitas drogas anticâncer alvo rapidamente dividindo as células cancerosas, podem também danificar dividindo rapidamente as células normais como as células do folículo piloso, epitélio intestinal e medula óssea. Por exemplo, drogas anticâncer inibidores de topoisomerase alvo o processo de replicação do DNA de células cancerosas; Portanto, eles também inibem dividindo rapidamente as células normais. Todos os organismos vivos tem topoisomerases e estes topoisomerase inibidores mais provável impacto ambiental de ecossistemas6,10,11. Assim, uma plataforma de avaliação toxicológica de drogas usando um animal modelo é valiosa para tanto no desenvolvimento de fármacos e avaliação dos riscos ambientais.
Neste artigo, descrevemos os protocolos detalhados para testar a toxicidade de etoposide, que é um agente anticâncer clínico que alvos topoisomerase II, como um produto químico tóxico de modelo em c. elegans. Para este fim, descreveremos o método de medição do tamanho do corpo e o número total de ovos postos em c. elegans , tratados com etoposide.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Affymetrix, USA</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td>Wild type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>E1383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software (ver 1.4)</td>
			<td>Natinoal Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>107213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &#215; 10 mm Petri dish</td>
			<td>SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td>10035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 &#215; 15 mm Petri dish</td>
			<td>SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans

Avaliação toxicológica é crucial para entender os efeitos das substâncias químicas sobre organismos vivos nos campos da ciência biológica básica e aplicada. Um solo não-mamíferos redondo verme Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo valioso para estudos de toxicologia, devido à sua conveniência e a falta de questões de ética animal, em comparação com sistemas de animais mamíferos. Neste protocolo, é descrito um procedimento detalhado de avaliação toxicológica de substâncias químicas em c. elegans . Uma droga anticancerígena clínica, etoposide, quais destinos humano topoisomerase II e inibe a replicação do DNA de células cancerosas humanas, foi selecionada como um modelo de testes químicos. Idade-sincronizado c. elegans ovos foram expostos a dimetilsulfóxido (DMSO) ou etoposide, e então o crescimento de c. elegans foi monitorado diariamente por 4 dias pela observação de microscópio estéreo. O número total de ovos assente de c. elegans , tratados com DMSO ou etoposide foi também contada usando o microscópio estéreo. Tratamento de Etoposide afetado significativamente o crescimento e a reprodução de c. elegans. Por comparação do número total de ovos de vermes com períodos de tratamento diferentes de produtos químicos, pode decidir-se que a toxicidade reprodutiva de produtos químicos na reprodução de c. elegans é reversível ou irreversível. Estes protocolos podem ser úteis para tanto no desenvolvimento de várias drogas e avaliação de riscos de tóxicos ambientais.

O tratamento de etoposide (24-96 h) retardado significativamente o crescimento de c. elegans. Após 96 horas de incubação, vermes etoposide-tratados cresceram 0,86 mm de comprimento, enquanto os vermes de veículo-tratados cresceram a 1,04 mm (Figura 1). Retardo de crescimento também aparentemente foi observado sob observação microscópio estéreo (Figura 2). Começamos a ver os ovos do veículo-tratados vermes a 72...

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Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Um protocolo básico para avaliar a toxicidade de produtos químicos em um animal modelo, Caenorhabditis elegans, é descrito. O método é conveniente e útil para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, bem como para a avaliação de risco de diversos poluentes ambientais.

Medir o efeito de produtos químicos sobre o crescimento e a reprodução de Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

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De alta freqüência Ecocardiografia de alta resolução: primeira evidência de não-invasivos Medida repetida de Strain miocárdico, contratilidade, e regurgitação mitral no coração Isquemia-reperfundidos murino

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Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

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