Name: multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform at JoVE.com

يود المؤلفون الاعتراف بالمساهمات من المؤشرات الحيوية والمناعية-فحوصات فريق "تطوير المنتج" لتنمية المقايسة. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر تك فيجيني, Inc. للجهود التعاونية في تصميم حزم برامج تحليل البيانات.

<ol>
	<li>Stanley, A. C., Lacy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+for+cytokine+secretion.">Pathways for cytokine secretion.</a> Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).</li><li>Nicola, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+pleiotropy+and+redundancy:+a+view+from+the+receptor.">Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor.</a> Stem Cells. 12, (1994).</li><li>Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+subunits+of+cytokine+receptors+and+the+functional+redundancy+of+cytokines.">Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines.</a> Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).</li><li>Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytokinome:+a+new+challenge+for+systems+biology.">Human Cytokinome: a new challenge for systems biology.</a> Bioinformation. 5, 166-167 (2010).</li><li>Capone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+Cytokinome+Profile+Evaluation:+A+Tool+to+Define+New+Diagnostic+and+Prognostic+Markers+of+Cancer+Using+Multiplexed+Bead-Based+Immunoassays.">Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays.</a> Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).</li><li>Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cytokine+networks+fuel+inflammation:+Toward+a+cytokine-based+disease+taxonomy.">How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy.</a> Nat Med. 19, 822-824 (2013).</li><li>Tse, E., Kwong, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+lymphoma:+Microenvironment-related+biomarkers.">T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers.</a> Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).</li><li>Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+chemo-cytokine+profiles+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+diseases.">Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).</li><li>Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cytokine+biomarkers+in+heart+failure.">Multiple cytokine biomarkers in heart failure.</a> Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).</li><li>Gobel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+coagulation+factor+XII+drives+adaptive+immunity+during+neuroinflammation+via+CD87-mediated+modulation+of+dendritic+cells.">Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells.</a> Nat Commun. 7, 11626 (2016).</li><li>Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+marginal+zone+B+cells+in+mice:+a+novel+subset+with+dormant+self-reactivity.">Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity.</a> Sci Rep. 6, 27687 (2016).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Bcl11b+is+specifically+expressed+in+group+2+innate+lymphoid+cells+and+is+essential+for+their+development.">The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development.</a> J Exp Med. 212, 865-874 (2015).</li><li>Pelly, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4-producing+ILC2s+are+required+for+the+differentiation+of+TH2+cells+following+Heligmosomoides+polygyrus+infection.">IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection.</a> Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).</li><li>. LEGENDplex Multiplex Assays Available from: <a target="_blank" href="https://www.biolegend.com/legendplex">https://www.biolegend.com/legendplex</a> (2017)</li><li>Autieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-+and+anti-inflammatory+networks+in+atherosclerosis.">Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis.</a> ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).</li><li>West, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+cytokine+networks+in+colorectal+cancer.">Emerging cytokine networks in colorectal cancer.</a> Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).</li><li>Becher, B., Spath, S., Goverman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+networks+in+neuroinflammation.">Cytokine networks in neuroinflammation.</a> Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).</li></ol>

يعمل الكتاب بيوليجيند، التي تقوم بتصنيع الكواشف الموصوفة في هذه المخطوطة. فيجن التكنولوجيا، وشركة تطوير برمجيات تحليل البيانات ليجيندبليكس التي تستخدم لتحليل البيانات التي تم إنشاؤها من التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة.

شكل الإنزيم الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن أن توفر الكمي قوية للملامح وسيط قابل للذوبان في العينات البيولوجية التي قدمت المجرب قد تقنية المختبرات الجيدة وتلتزم بالبروتوكول الموصى بها.
وهناك العديد من الخطوات الأساسية التي ينبغي اتباعها من أجل ضمان نتائج موثوقة. أولاً، يجب أن يسمح بمعايير المؤتلف إعادة تشكيل في المخزن المؤقت للمقايسة كامل الوقت الموصى بها، وبعد إلا تضعف في أنابيب البولي بروبلين. أنابيب البوليستيرين يمكن تعزيز التمسك بالبروتينات الجدار الأنابيب، مما يمكن أن يؤدي إلى إشارات منخفضة عند إنشاء المنحنى المعياري. ثانيا، تهتز أثناء حضانة الخطوات المناسبة أمر بالغ الأهمية. دون الانفعالات المناسبة، يمكن أن تعوق شدة خصائص ربط الخرز المقايسة. وباﻹضافة إلى ذلك، الغسيل المناسبة بين الخطوات حضانة مطلوب أيضا. يجب ضمان المجرب إزالة الكواشف الزائدة من الآبار قبل البدء في الخطوة التالية في البروتوكول. يجب أن يكون الأمثل إعدادات الصكوك cytometer تدفق المستخدمة في استجواب الخرز المقايسة كذلك. على وجه الخصوص، يجب تعديل إعدادات PMT لضمان الفصل السليم حبة ونطاقات دينامية واسعة النطاق للمنحنيات القياسية. أخيرا، يجب أن حبات فقط قبل يجري تحليله في سيتوميتير، فورتيكسيد لضمان تعليق مناسب وتجنب تشكيل المجاميع التي يمكن أن تحرف النتائج.
يمكن تعديل هذا البروتوكول يحتمل أن تكون لتحليل الأنسجة هوموجيناتيس، فضلا عن أنواع نموذج بحث في هذه المخطوطة، شريطة الباحث على استعداد لتحسين بروتوكول تحلل بها قبل إجراء فحوصات لوحة كبيرة وكاملة. تقنية الفعلية تختلف بطبيعة الحال تبعاً لنوع النسيج؛ ومع ذلك، عموما البروتوكول ينبغي استخدام المخزن مؤقت الأس الهيدروجيني محايدة المحتوية على تركيزات فسيولوجية من الأملاح الأيونية، لا المواد الكيميائية يشوه، ويفضل أن لا المنظفات. إذا كان يجب استخدام المنظفات، ينبغي أن يظل تركيز المنظفات غير الأيونية كحد أدنى (مثلاً لا يزيد عن 1 في المائة). المخزن المؤقت ينبغي أن تتضمن أيضا مثبطات البروتياز كافية لمنع تدهور proteolytic البروتينات المستهدفة. بغض النظر عن تحلل البروتوكول المستخدم، يجب تثفيل الاستعدادات النهائية لإزالة الجسيمات قبل التحليل.
فيما يتعلق بالقيود المقايسة، تركيزات أهدافا أكثر في أنواع العينات البيولوجية يمكن أن تختلف إلى حد كبير. من أجل قياس تركيزات أكثر بشكل صحيح، يجب أن تندرج ضمن القيم العلوية والسفلية للمنحنى المعياري. استقراء قيم المنحنى ليست موثوقة بالضرورة، ولا يوصي. المحققين ولذلك يجب تحسين تخفيف تلك العينات خاصة في تجارب نموذجية قبل أن يعمل فحص الكامل--لوحة. وباﻹضافة إلى ذلك، التحضير الدقيق للعينات البيولوجية تكون جزيئي أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الشكل المقايسة. عينات ليبيميك أو هيموليزيد، أو تحتوي على بروتين الحطام سوف تؤثر على جسم مستضد التفاعلات التي تحدد المبدأ الأساسي لهذه المناعة، وتقديم النتائج التي يتم أونينتيربريتابل.
هذا الفحص هام فيما يتعلق بالأساليب القائمة على القياس الكمي لعدة أسباب. عند تشغيل بشكل صحيح، يمكن أن قوانتيتاتي شكل الإنزيم تحليلها تصل إلى 13 من عينة استخدام كميات أقل بكثير مما ستكون هناك حاجة تحليل العينة باستخدام فحوصات أليسا التقليدية. تنسيق هذا التحليل أيضا لا تتطلب الأجهزة مخصصة من أجل إجراء. هذه ميزة مقارنة الأخرى المتاحة تجارياً تحديدكم المستندة إلى حبة كما يمكن تشغيل الفحص استخدام أي عدد من سيتوميتيرس تدفق استخداماً.
التحقيق العلمي في الدور الذي تقوم به العوامل يفرزها وسيتوكين الشبكات في الصحة والمرض أخذ في التوسع. تنسيق التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة يمكن أن يكون أداة قيمة للباحثين تسعى إلى فهم هذه الظواهر معقدة ومتعددة الجوانب. بدأت برامج البحوث الطبية البيولوجية النشطة لاستكشاف دور شبكات سيتوكين في ليس فقط المناطق المعمم مثل التهاب6، ولكن أيضا في سياق الدول أمراض محددة مثل تصلب الشرايين والسرطان ونيوروينفلاميشن 1516،،17. مما لا شك فيه، سوف يواصل التحقيق تنمو في هذه المناطق كما يوسع البحث عن علاجات جديدة لعلاج هذه الحالات المزمنة. الحاجة إلى التقدير الكمي دقيقة وموثوق بها للوسطاء للذوبان المرتبطة بهذه الأمراض سوف تظل أولوية حاسمة لبحث.

في دورها كجزيئات إرسال الإشارات للذوبان، السيتوكينات التوسط في عمليات منسقة للغاية والمتعددة العوامل التي تحكم المضيف الاستجابات المناعية. أنها يتم التعبير عنها من خلال جميع مراحل عملية تحريضية، من البدء بالقرار، وتنظيم شبكة تفاعل معقد الذي يشمل التوليف الخاصة بهم، وأن تلك المستقبلات الخلوية1. شبكة الاتصالات هذه الطبقات مع تعقيد الذي يذهب إلى أبعد من علاقات التآزر أو العدائية التي قد تكون موجودة بين المكونات الفردية. وفي الواقع، معروفة السيتوكينات العديد من تقاسم الوظائف الزائدة عن الحاجة أو متداخلة جزئيا على الأقل2،3.
النهج بيولوجيا النظم المتكاملة التي كمياً تحليلها سيتوكين متعددة في نفس الوقت تقوم حاليا بتوفير فهم شامل متزايد سيتوكينوميس الفريدة التي تنسق الاستجابات المناعية الكامنة وراء المرض متعددة الدول4،5. هذه المرض الدول مجموعة من التهاب المعمم للسرطان والشروط التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية6،7،،من89.
يمكن استجوابهم هذه الشبكات سيتوكين فعالية استخدام تحديدكم المستندة إلى حبة ليجيندبليكس. هذه الاختبارات تستند على نفس المبدأ ساندويتش Enzyme-Linked المرتبط بالانزيم (ELISA)، واستخدام fluorescence ترميز الجزئي المجالات الخرز الصغير بالتقاط الأجسام المضادة تساهمي تعلق على سطحها. هذه الأجسام المضادة هي المعطل تداولها في المناطق السطحية أصغر بكثير من تلك التي يتطلبها التقليدية أليسا تنسيقات. وهذا يتيح هذه الاختبارات تتم مع أقل بكثير من حجم العينة، بينما في الوقت نفسه الحد غير محددة ملزمة وتوفير متعدد تحليل لتحليلها عدة.
الفحص المبينة في هذا البروتوكول يستخدم هذه التكنولوجيا قوانتيتاتي تصل إلى 13 أهداف في وقت واحد. البيانات المستمدة من هذا التحليل يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعة متنوعة من سيتوميتيرس تدفق المتاحة عموما، وعلى عكس الاختبارات الأخرى المتاحة لا تتطلب استخدام الأجهزة الخاصة بفحص مخصص. مع ملف كتالوج الآخذة في اتساع من لوحات أكثر تم التحقق من صحتها، استخدمت هذه الاختبارات في عدة البحوث الطبية الحيوية الجارية مشاريع10،11،،من1213.
للبرهنة على سهولة وفائدة تنسيق المقايسة، في هذه التجربة نستخدم لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس" إلى كوانتيتاتي فصل 13 تركيزات سيتوكين من supernatants ثقافة الأنسجة التي تم الحصول عليها من سبلينوسيتيس الماوس مثقف تحت متعددة شروط محفزة. بالإضافة إلى زراعة الأنسجة سوبيرناتانتس، هذا التحليل يمكن أيضا إجراء باستخدام عينات المصل أو البلازما.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740005</td>
			<td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD28 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102112</td>
			<td>Clone 37.51, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WP6111560</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-130</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene MicroFACS Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-842-90</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Four pipette sizes (0.2-2&#181;L, 2-20&#181;L, 20-200&#181;L, 100-1000&#181;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FA10011G</td>
			<td>capable of dispensing 5 &#956;L to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75002410</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9885747</td>
			<td>12 x 75 mm round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-8274</td>
			<td>Escherichia coli O26:B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson B200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z305359</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666505</td>
			<td>1.5 mL polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-662</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform

تحديدكم المستندة إلى حبة تستخدم نفس المبدأ الأساسي تحديدكم ساندويتش. التقاط الخرز، التي يمكن أن تكون متباينة من حيث الحجم والكثافة الأسفار الداخلية اللوفيكوسيانين (APC)، وهي مترافق للأجسام المضادة المحددة إلى أكثر خاصة. وبعد ذلك، هو المحتضنة لوحة مختارة من مجموعات حبة التقاط محددة مع عينة بيولوجية تحتوي على تحليلها المستهدفة المحددة لالتقاط الأجسام المضادة. يتم إضافة جسم كشف بيوتينيلاتيد كوكتيل، الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل التقاط السندوتشات حبة-أكثر-كشف الأجسام المضادة.
وأخيراً، إضافة ستريبتافيدين-فيكوريثرين (SA-PE)، الذي يربط بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة، توفير كثافات الفلورسنت إشارة ما يتناسب مع كمية أكثر منضم. PE الفلورسنت إشارة مناطق الخرز أكثر حدة هو كمياً استخدام التدفق الخلوي، وتركيزات معينة تحليلها مصممون على استخدام برمجيات تحليل البيانات والمنحنى المعياري ولدت في المقايسة.
في هذه التجربة، نحن نستخدم لوحة سيتوكين مساعد تي ماوس لقياس تركيز 13 أهداف سيتوكين منفصلة في supernatants ثقافة الأنسجة التي تم جمعها من الماوس سبلينوسيتيس مثقف تحت مختلف الظروف تنشيطية في وقت واحد.

هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن استخدام منصة المستندة إلى حبة المناعة قوانتيتاتي في وقت واحد الملامح سيتوكين من العينات البيولوجية باستخدام cytometer تدفق. كانت العينات البيولوجية المستخدمة في هذا المثال supernatants ثقافة الخلية من الماوس سبلينوسيتيس أنه قد تم سابقا المحتضنة تحت شروط تفعيل مختلف، على الرغم من أن شكل المقايسة كما تم التحقق من للاستخدام مع عينات المصل أو البلازما.
وتستخدم البيانات الناتجة من الفحص تشييد المنحنيات القياسية لجميع التحاليل في الفريق متعدد. برنامج تحليل البيانات يصنف كل أكثر خاصة استناداً إلى حجم حبة فريدة من نوعها وكثافة آسيا والمحيط الهادئ، ويوضحها لهم استخدام مراسل PE. وأظهرت النطاقات الحيوية، فضلا عن حساسية المقايسة عندما تآمروا على نطاق سجل--سجل في الشكل 2A. يستخدم البرنامج بيانات الفحص وخوارزميه ملائمة منحنى 5-المعلمة لدقة حساب تركيزات تحليلها في المستخدم ليس فقط قدمت عينات بيولوجية ولكن أيضا حدود الكشف عن نهاية جميع المنحنيات القياسية (1 الجدول عالية ومنخفضة ). كما يوفر التنسيق المبينة في هذا البروتوكول المقايسة قوية عالية الدقة. وترد البيانات في الشكل 2 (ب) و 2 (ج) تصور تباين الفحص داخل كل أكثر. تم تحليل تركيزات البروتين القياسية منفصلة اثنين (ارتفاع وانخفاض) في تحليل واحد مع replicates 16 لكل عينة. يمثل الرقم 2 و 2D تقلب المقايسة بين الوكالات لتحليلها المستهدفة من ثلاثة فحوصات مستقلة. كما مع التجارب الدقة داخل-المقايسة، حللت التركيزات القياسية العالية والمنخفضة مع 3 وإنشاء نسخ متماثلة في كل من التجارب المستقلة. تقلب الدنيا في تركيز البروتينات المستهدفة المحسوبة واضحة للعيان.
بغية إظهار فائدة فحوصات سيتوميتريك القائم على حبة في استجواب سيتوكين التعبير الملامح، كانت المحتضنة الماوس سبلينوسيتيس تحت ظروف تفعيل مختلف. بالإضافة إلى عنصر تحكم أونستيمولاتيد، كانت الخلايا المحتضنة أيضا مع لبس والأجسام المضادة-CD3/مكافحة-CD28، أو phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات وإيونوميسين. وقد جمعت supernatants ثقافة الخلية ح 48 أحدث وجزيئي استخدام لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس". تمثل نتائج التقدير الكمي من هذه التجربة في الشكل 3 ، وأثر شروط التحفيز على تركيزات سيتوكين هو بوضوح.
النتائج المذكورة أعلاه نموذجية، طالما المجرب قد تقنية المختبرات الجيدة ويتبع البروتوكول المقايسة المقدمة. يمكن أن تنشأ مصادر الخطأ في هذا الشكل المقايسة من الانحرافات في أوقات الاحتضان، مجلدات كاشف، الغسيل، أو من غير لائق PMT إعدادات cytometer تدفق المستخدمة لتحليل العينات. في الشكل 4A مبعثر يظهر الأرض من مقايسة نجاح 2 السكان حبة المتميزة التي تم تعريفها بوضوح. ويمكن مقارنة هذا إلى الشكل 4 باء، التي أدت فيها الغسيل وبروتوكول التقيد بالفقراء إلى المجاميع حبة الذي طمس الشعبين. وباﻹضافة إلى ذلك، كما يتضح من تحت الأنقاض في الربع الأيسر السفلي، تم تصدير سيتوميتير مجموع الأحداث للتحليل بدلاً من الشكل المفضل لبوابة الأحداث فقط. سيتوميتير المناسبة إعداد أمر بالغ الأهمية لتوليد بيانات موثوقة في هذا التحليل. في 4 الشكل السليم PMT تسمح إعدادات لحل كل من تحليلها 6 في قناة تصنيف آسيا والمحيط الهادئ. سيؤدي إلى سوء PMT إعدادات بيانات مماثلة لتلك المعروضة في الشكل 4 فيها السكان حبة مع تداخل تصنيف الكثافات قناة آسيا والمحيط الهادئ. هذا سوف يبطل المقايسة نظراً لأنه سيكون من المستحيل لحساب تركيزات أكثر دون السكان محددة بوضوح من حبات المقايسة.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg"> 
رقم 2: النطاقات المنحنى القياسي ودقة التحليل. (أ) ممثل منحنى المعياري التي تم إنشاؤها باستخدام لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس". يجب تشغيل منحنى قياسي بكل مقايسة. (ب-ج) الدقة داخل المقايسة. تم تحليل عينتين بتركيزات مختلفة من البروتينات المستهدفة (ارتفاع وانخفاض) في تحليل واحد مع replicates 16 لكل عينة. وتمثل البيانات يعني + الانحراف المعياري. (د-ه) دقة التحليل بين الوكالات. وتم تحليل عينتين بتركيزات مختلفة من البروتينات المستهدفة (ارتفاع وانخفاض) في ثلاثة فحوصات مستقلة مع replicates 3 لكل عينة. وتمثل البيانات يعني + الانحراف المعياري. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg"> 
الشكل 3: القياس الكمي لنتائج الممثل. كانت مثقف سبلينوسيتيس الماوس (1 × 106 خلايا) عند 37 ° C + 5% CO2 تحت ظروف مختلفة: أونستيمولاتيد، لبس (100 نانوغرام/ملليلتر)، αCD3 (1 ميكروغرام/مل المغلفة بلوحة) + αCD28 (1 ميكروغرام/مل القابلة للذوبان)، سلطة النقد الفلسطينية (20 نانوغرام/ملليلتر) + إيونوميسين (500 نانوغرام/ملليلتر). Supernatants ثقافة جمعت بعد 48 ساعة ثم كمياً باستخدام لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس". تكون التشكيلات الجانبية للتعبير سيتوكين التفاضلية في الاستجابة لشروط التحفيز مرئية بوضوح. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg"> 
الشكل 4: نتيجة ناجحة مقابل فحوصات غير ناجحة. (أ) سيكون نجاح فحوصات السكان حبة متميزة للسكان ميكروسفيري. (ب) سيكون فحوصات غير ناجحة لفصل السكان الفقراء وحبه المجاميع، والعديد من الأحداث التي تم جمعها. (ج) نجاح فحوصات حددت بوضوح كثافة في قناة fluorescence التصنيف التي سهلة للبوابة وتحديدها كمياً. (د) فحوصات غير ناجحة سوف يكون ضعيف فصل وتصنيف الكثافات التي تتداخل مع السكان حبة متعددة، مما يجعل من الصعب التحديد الكمي. ويمكن تجنب العديد من هذه الأخطاء من خلال التقيد بالبروتوكول الفحص الدقيق. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">المنحنى المعياري</td>
			<td colspan="2">حساسية (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>أكثر</td>
			<td>صيغة تناسب</td>
			<td>السيرة الذاتية</td>
			<td>R2</td>
			<td>دقيقة.</td>
			<td>ماكس.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77 في المائة</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32 في المائة</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>تنف-Α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48 في المائة</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>td>1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>إيل-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36 في المائة</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81 في المائة</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-17A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92 في المائة</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0.79 في المائة</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>إيل-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11 في المائة</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

الجدول 1: تركيب المنحنى المعياري وتحليل الحساسية- واستخدمت برامج تحليل البيانات لإنشاء منحنيات قياسية لجميع التحاليل الواردة في التحليل متعدد. ينطبق على منحنى 5-معلمة قوية المناسب الخوارزمية إلى تمييع المعايير سلسلة من الفحص هذا التحليل مؤتمتة بالكامل وكانت تستخدم أيضا لتحديد حساسية الفحص باستخدام حدود النظرية للكشف.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform at JoVE.com

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

ويصف هذا البروتوكول التحديد الكمي لأهداف سيتوكين متعددة في وقت واحد في supernatants ثقافة الأنسجة التي تم جمعها من سبلينوسيتيس الماوس حفز استخدام حبة متعدد المناعة استناداً إلى النظام الأساسي وسيتوميتير تدفق.

متعدد سيتوكين التنميط من سبلينوسيتيس الماوس حفز استخدام منصة المستندة إلى حبة سيتوميتريك المناعة

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

تطوير اللعابية الأجسام المضادة المناعية المتعددة لقياس التعرض البشري للمسببات البيئية

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

حبة على أساس مقايسة متعدد لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

الآلي التحليل السلوكي لكبير C. ايليجانس السكان استخدام واسعة مجال-من-عرض "تتبع النظام الأساسي"

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

المضادات الحيوية Dereplication باستخدام منصة مقاومه المضادات الحيوية

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

هضم عيون الماوس كله لتحليل Cytometric تدفق متعدد المعلمة من البلاعات أحادية النوى

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...