Name: multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform at JoVE.com

Les auteurs tiennent à souligner les contributions des biomarqueurs et Immuno-essais équipe de développement de produits pour le développement du dosage. En outre, nous tenons à remercier Vigene Tech, Inc. pour leurs efforts de collaboration dans la conception de progiciels des analyse les données.

<ol>
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Les auteurs sont employés par BioLegend, qui fabrique les réactifs décrits dans ce manuscrit. Vigene Tech, Inc. a développé le logiciel d’analyse de données LEGENDplex qui est utilisé pour analyser les données générées par le test décrit dans ce manuscrit.

Le format d’essai décrit dans le présent protocole peut fournir robuste quantification des profils de médiateur soluble dans des échantillons biologiques fournis l’expérimentateur a bon laboratoire technique et adhère au protocole recommandé.
Il y a plusieurs étapes clés qui doivent être suivies pour garantir des résultats fiables. Tout d’abord, les normes recombinants doivent pouvoir reconstituer dans du tampon le recommandé à plein temps et après seulement dilué dans des tubes en polypropylène. Tubes polystyrène peuvent favoriser l’adhérence des protéines de la paroi des tubes, qui peuvent conduire à des signaux faibles lors de la génération de la courbe d’étalonnage. Deuxièmement, secouer pendant les étapes d’incubation adéquate est essentielle. Sans agitation appropriée, les caractéristiques de liaison, des perles d’essai peuvent être gravement entravées. En outre, lavage correcte entre les étapes d’incubation est également requis. L’expérimentateur doit s’assurer que les excès réactifs soient écartés les puits avant de commencer l’étape suivante dans le protocole. Paramètres d’instruments pour le cytomètre en flux utilisés pour interroger les perles de dosage doivent être optimisés aussi bien. En particulier, les paramètres de PMT doivent être réglées de manière séparation appropriée de perle et des plages dynamiques larges pour les courbes standards. Enfin, juste avant d’être analysés sur le cytomètre, les billes doivent être mixés pour assurer une suspension adéquate et d’éviter la formation d’agrégats qui peuvent fausser les résultats.
Ce protocole peut être potentiellement modifié pour analyser des homogénats de tissus ainsi que les types d’échantillons examinés dans ce manuscrit, pourvu que le chercheur est prêt à optimiser leur protocole de lyse avant d’effectuer des essais de plaque grand, plein. La technique réelle dépendra bien sûr de type tissulaire ; Cependant, en général le protocole doit utiliser un tampon de pH neutre contenant des concentrations physiologiques des sels ioniques, sans dénaturation des produits chimiques et préférence pas de détergent. Si un détergent doit être utilisé, les concentrations de détergent non ionique doivent être maintenues au minimum (par exemple pas plus de 1 %). La mémoire tampon doit également contenir des antiprotéases suffisante pour empêcher la dégradation protéolytique de protéines cibles. Quel que soit le protocole de lyse utilisé, les derniers préparatifs doivent être centrifugés pour enlever les particules avant l’analyse.
Au sujet des limites de dosage, les concentrations d’analytes cibles dans types d’échantillons biologiques peuvent varier grandement. Afin de correctement quantifier les concentrations de la substance à analyser, ils doivent être comprise entre les valeurs inférieure et supérieure pour la courbe d’étalonnage. Extrapolation des valeurs de la courbe n’est pas nécessairement fiable et n’est pas recommandé. Les enquêteurs doivent donc optimiser dilutions de leurs échantillons particuliers dans des expériences pilotes avant d’exécuter une analyse complète-plaque. En outre, la préparation minutieuse des échantillons biologiques à doser est primordiale pour le succès de ce format de test. Échantillons lipémiques, hémolysés, ou contenant des débris de la protéine seront affectent les interactions anticorps antigène qui définissent le principe essentiel de ce test immunologique et restituer des résultats ininterprétables.
Ce test est significatif en ce qui concerne les méthodes de quantification existantes pour plusieurs raisons. Lorsque exécuté correctement, le format du test peut doser jusqu'à 13 analytes auprès d’un échantillon en utilisant des volumes beaucoup plus faible qu’il faudrait analyser l’échantillon à l’aide des tests ELISA traditionnelles. Ce format d’essai ne nécessite pas instrumentation dédiée afin d’être exécutée. Il s’agit d’un avantage par rapport aux autres immunologiques perle disponibles dans le commerce comme le dosage peut être exécuté à l’aide de n’importe quel nombre de cytomètres couramment utilisés.
Une enquête scientifique sur le rôle joué par les cytokines et facteurs sécrétés réseaux en santé et la maladie se développe. Le format de test décrit dans ce manuscrit peut être un outil précieux pour les chercheurs qui cherchent à comprendre ces phénomènes complexes et multiformes. Programmes de recherche biomédicale active commencent à explorer le rôle des réseaux de cytokines de l’inflammation tels que généralisés des zones non seulement6, mais aussi en contexte des États de maladie spécifiques telles que l’athérosclérose, le cancer et neuro-inflammation 15,16,17. Sans aucun doute, enquête va continuer à croître dans ces domaines comme la recherche de nouvelles thérapies traiter ces affections chroniques se développe. La nécessité d’une quantification précise et fiable des médiateurs solubles associés à ces maladies demeurera une priorité de recherche critique.

En tant que molécules de signalisation solubles, cytokines médier les processus hautement coordonnées et multifactorielles qui régissent les réactions immunologiques de l’hôte. Ils sont exprimés durant toutes les étapes du processus inflammatoire, de l’initiation à la résolution et régulent un réseau d’interactions complexes qui comporte leur propre synthèse et celle de leurs récepteurs cellulaires1. Ce réseau de communication est posé avec une complexité qui dépasse les relations synergiques ou antagonistes qui peuvent exister entre les différents composants. En effet, nombreuses cytokines sont connus pour partager les fonctions redondantes ou au moins partiellement superposés2,3.
Approches de la biologie des systèmes intégrés qui quantifient simultanément plusieurs analytes de cytokine fournissent actuellement une compréhension plus complète de le cytokinomes unique qui orchestrent les réponses immunitaires sous-jacente aux maladies multiples dispose de4,5. Ces États de maladie s’étendent d’une inflammation généralisée au cancer, neuro-dégénératives et les maladies cardiovasculaires6,7,8,9.
Ces réseaux de cytokines peut être interrogées efficacement à l’aide de LEGENDplex perle immunologiques. Ces tests sont basés sur le même principe que le sandwich enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) et utilisent des microsphères de fluorescence encodé avec des anticorps de capture de façon covalente à leur surface. Ces anticorps sont immobilisées sur des surfaces beaucoup plus petites que celles requises par les formats traditionnels de ELISA. Cela permet à ces tests d’être interprétée avec beaucoup moins volume de l’échantillon, alors qu’en même temps réduisant non-spécifiques contraignant et fournissant multiplexés analyse plusieurs analytes.
Le test décrit dans ce protocole utilise cette technologie pour doser jusqu'à 13 cibles simultanément. Données de cet essai peuvent être obtenues en utilisant une grande variété de cytomètres couramment disponibles et contrairement à d’autres tests disponibles ne nécessitent pas l’utilisation de l’instrumentation de test spécifique dédiée. Avec un catalogue en pleine expansion des panneaux de l’analyte validés, ces tests ont été utilisés dans plusieurs travaux de recherche biomédicale projets10,11,12,13.
Pour démontrer la facilité et l’utilité du format dosage, dans cette expérience que nous permet de quantifier un panel de cytokine souris T helper 13 distincts des concentrations de cytokine de surnageants de culture de tissus obtenus à partir des splénocytes de souris cultivées sous multiple conditions de stimulation. Outre les surnageants de culture de tissus, ce test peut également être effectué en utilisant des échantillons de sérum ou de plasma.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>366816</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>740005</td>
			<td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3&#949; antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100314</td>
			<td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD28 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102112</td>
			<td>Clone 37.51, low endotoxin, azide free format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WP6111560</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MSVMHTS00</td>
			<td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-130</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene MicroFACS Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-842-90</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Four pipette sizes (0.2-2&#181;L, 2-20&#181;L, 20-200&#181;L, 100-1000&#181;L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Channel Pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FA10011G</td>
			<td>capable of dispensing 5 &#956;L to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88880023</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75002410</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9885747</td>
			<td>12 x 75 mm round bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-8274</td>
			<td>Escherichia coli O26:B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson B200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z305359</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z666505</td>
			<td>1.5 mL polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Polypropylene Plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-662</td>
			<td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform

Perle immunologiques utilisent le même principe de base que les immuno-essais "sandwich". Capture de billes, qui peuvent être différenciés par la taille et l’intensité de fluorescence allophycocyanin interne (APC), sont conjugués d’anticorps spécifiques d’un analyte spécifique. Ensuite, un groupe sélectionné de capture définies perle ensembles est incubé avec un échantillon biologique contenant des analytes cibles spécifiques à l’anticorps de capture. Un anticorps de détection biotinylé cocktail est ajouté, ce qui conduit à la formation des sandwichs de perle-analyte-détection anticorps de capture.
Enfin, streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) est ajoutée, qui se lie à l’anticorps de détection biotinylés, fournissant les intensités du signal fluorescent proportionnellement à la quantité d’analyte lié. Le PE fluorescent signal des régions de l’analyte spécifique perles quantifiée à l’aide de cytométrie en flux et les concentrations d’analytes particulière sont déterminées à l’aide du logiciel d’analyse de données et la courbe d’étalonnage générée lors de l’essai.
Dans cette expérience, nous utilisons un panneau de cytokines de souris T helper pour quantifier simultanément la concentration de 13 cibles de cytokines distinctes dans les surnageants de culture de tissus prélevés de splénocytes de souris cultivées dans différentes conditions de stimulation.

Ce protocole montre comment une plateforme de test immunologique axée sur la perle peut être utilisée pour quantifier la cytokine profils provenant d’échantillons biologiques à l’aide d’un cytomètre en flux simultanément. Les échantillons biologiques utilisés dans cet exemple sont les surnageants de culture de cellules de splénocytes de souris qui avaient été préalablement incubées dans diverses conditions d’activation, bien que le format d’essai a également été validé pour utilisation avec des échantillons de sérum ou de plasma.
Les données générées par le test sont utilisées pour construire les courbes d’étalonnage pour tous les analytes dans le panneau multiplex. Le logiciel d’analyse de données classifie chaque analyte particulier basé sur une taille de perle unique et l’intensité de l’APC et quantifie les à l’aide d’un journaliste de PE. Les plages dynamiques, ainsi que la sensibilité de l’essai est démontrés lorsque tracées sur une échelle logarithmique en Figure 2 a. Le logiciel utilise les données de test et un algorithme d’ajustement de courbe de 5 paramètres pour calculer avec précision non seulement les concentrations d’analytes dans utilisateur fourni des échantillons biologiques, mais aussi les limites de détection sur deux extrémités haute et basse de toutes les courbes d’étalonnage (tableau 1 ). Le format décrit dans le présent protocole prévoit également la précision de dosage très robuste. Dans la Figure 2 b et 2C données sont présentées illustrant la variabilité intra-essai de chaque analyte. Deux concentrations distinctes de protéines standard (haute et basse) ont été analysées lors d’un essai avec 16 répétitions pour chaque échantillon. Figure 2 et 2D représentent la variabilité inter-essai des analytes cibles de trois tests indépendants. Comme avec les expériences de précision intra-essai, hautes et basses concentrations standards ont été analysées avec 3 réplique dans chacune des expériences indépendantes. Variabilité minime dans la concentration calculée de protéines cibles est clairement visible.
Afin de démontrer l’utilité des tests de cytométrie de flux axées sur le talon en interrogeant les profils d’expression des cytokines, des splénocytes de souris ont été incubées dans diverses conditions d’activation. Outre un contrôle non stimulée, les cellules ont été incubées également avec les vinyles, les anticorps anti-CD3/anti-CD28, ou phorbol 12-myristate 13-acétate et ionomycine. Les surnageants de culture de cellules ont été récoltées 48 h plus tard et analysée à l’aide du panneau de cytokine souris T helper. Les résultats de la quantification de cette expérience sont représentées dans la Figure 3 et l’effet des conditions de stimulation sur les concentrations de cytokines est clairement délimitée.
Les résultats décrits ci-dessus sont typiques, aussi longtemps que l’expérimentateur a bon laboratoire technique et suit le protocole d’essai prévu. Sources d’erreur dans ce format d’essai peuvent survenir de déviations dans les temps d’incubation, les volumes de réactifs, de lavage, ou de certains paramètres de PMT sur le cytomètre en flux utilisé pour analyser les échantillons. Dans la Figure 4 a un scatter plot d’un essai réussi montre 2 populations distinctes de perle qui sont clairement définies. Cela peut être comparée à la Figure 4 b, où adhérence médiocre de lavage et de protocole ont conduit à des agrégats de perle qui brouillent les deux populations. En outre, comme en témoignent les débris dans le quadrant inférieur gauche, cytomètre total événements ont été exportées pour analyse, et non le format préféré des événements dépendants uniquement. Cytomètre adéquat mis en place est essentiel pour produire des données fiables dans ce test. Dans PMT bonne Figure 4 paramètres permettent la résolution de chacun des 6 analytes dans le chenal de classification d’APC. Certains paramètres de PMT seront traduira par des données semblable à celle présentée dans la Figure 4 où le canal de l’APC a des populations de perle avec des intensités de classification qui se chevauchent. Cela annulerait le test puisqu’il sera impossible de calculer les concentrations d’analyte sans les populations de perles de dosage clairement déterminées.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg"> 
Figure 2 : gammes courbe Standard et précision essai. (A) une standard courbe générée à l’aide du panneau de cytokine souris T helper. Une courbe d’étalonnage doit être exécutée avec chaque test. (B-C) Précision intra-essai. Deux échantillons avec des concentrations différentes de protéines cibles (haute et basse) ont été analysées lors d’un essai avec 16 répétitions pour chaque échantillon. Données sont représentées sous la moyenne + l’écart-type. (D-E) Précision inter-essai. Deux échantillons avec des concentrations différentes de protéines cibles (haute et basse) ont été analysés dans les trois essais indépendants avec 3 répétitions pour chaque échantillon. Données sont représentées sous la moyenne + l’écart-type. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg"> 
Figure 3 : Quantification de résultats représentant. Splénocytes de souris (1 x 106 cellules) sont cultivées à 37 ° C + 5 % de CO2 dans diverses conditions : non stimulés, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL de plaque-enduit) + αCD28 (1 µg/mL soluble), PMA (20 ng/mL) + ionomycine (500 ng/mL). Les surnageants de culture ont été prélevés après 48 h puis quantifiée à l’aide du panneau de cytokine souris T helper. Profils d’expression des cytokines différentielle en réponse aux conditions de stimulation sont clairement visibles. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg"> 
Figure 4 : résulte de succès contre les essais infructueux. (A) des essais réussis auront des populations distinctes de perle pour les populations de microsphères. (B) les essais infructueux aura séparation des populations pauvres, les agrégats de perle et trop d’événements collectés. (C) les essais réussis ont clairement défini intensités dans le canal de fluorescence de classification qui sont faciles à la porte et à quantifier. (D) les essais infructueux seront ont mal séparé et classification des intensités qui se chevauchent plusieurs populations de perle, ce qui rend difficile le dosage. Bon nombre de ces erreurs peuvent être évitées en respectant soigneusement le protocole d’essai. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Courbe d’étalonnage</td>
			<td colspan="2">Sensibilité (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyte</td>
			<td>Formule forme</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>Min.</td>
			<td>Max.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1,77 %</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1,32 %</td>
			<td>1</td>
			<td>1,9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48 %</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1,9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1,34 %</td>
			<td>1</td>
			<td>1,9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>TD>1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1,36 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1,81 %</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1,82 %</td>
			<td>1</td>
			<td>1,9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17 A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0,99 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0,92 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0,79 %</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1,16 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1,11 %</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

Tableau 1 : ajustement de la courbe d’étalonnage et de sensibilité. Le logiciel d’analyse de données a été utilisé pour générer des courbes standard pour tous les analytes contenus dans l’essai multiplex. Cette analyse entièrement automatique s’applique à une courbe de 5 paramètres robuste montage algorithme selon les normes de série de dilution de l’essai et a également été utilisée pour définir la sensibilité en utilisant les limites théoriques de détection.

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Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Ce protocole décrit la quantification des cibles multiples de cytokines simultanément dans les surnageants de culture de tissus prélevés de splénocytes de souris stimulés à l’aide de perle multiplex immunodosage base plate-forme et un cytomètre en flux.

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