Name: whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par l’Université de Zurich, l’IEF Marie Curie Grant (subvention no. TransEpigen-254797 à A.H.), un Advanced Grant de l’European Research Council (subvention no. MEDEA-250358 à UG) et un projet de recherche et développement technologique (subvention MecanX à U.G.) de SystemsX.ch, l’Initiative de la Suisse en biologie des systèmes.

1. fleur et la Fixation de la Silique
<ol><li>Récolte de fleurs et siliques de plantes synchronisés lors de l’ouverture de la première fleur. Remarque : Dans les conditions expérimentales utilisées ici, les plantes commencent à fleurir environ 21 jours après la transplantation de Murashige et Skoog (MS) des dalles au sol. Graines sont stratifiées pour 3 à 4 jours à 4 ° C et germent/cultivés sur MS plaques à 22 ° C/16 h de lumière et 18 ° C/8 h sombre pendant 8 à 10 jours, avant de transplanter le...

L’existence de nombreux boutons floraux au sein d’une inflorescence unique de l' Arabidopsis, couvrant toutes les étapes du développement de fleur, offre une occasion unique pour les études visant à caractériser l’effet d’un traitement ou d’une caractéristique du développement en même temps à travers les différentes étapes du développement floral. Un bon point de référence entre les différentes plantes individuelles est l’ouverture de la première fleur de l’inflorescence principale....

Fleurs sont parmi les plus importantes définissant des organes des angiospermes. Plantes dicotylédones est apparu il y a 90 millions ans1et diversifié si vite que leur apparition rapide a été décrit comme un « mystère abominable » par Charles Darwin,2. Les intérêts des chercheurs de l’usine de développement floral sont diverses. Certaines recherches ont porté sur la compréhension de l’origine évolutive de la fleur dans son ensemble, ni l’évolution des propriétés spécifiques d’anatomiques, structurales et fonctionnelles des fleurs3,4,5,6 . La forte variation dans la forme florale et structure, ainsi que les modes de reproduction sexuée et asexuée, en s’appuyant sur eux, faire la fleur, une structure très complexe. Cela a conduit à divers efforts pour caractériser les éléments d’anatomie et de la structure des organes floraux, en utilisant des techniques microscopiques photonique et électronique qui pourraient être associées à des études génétiques et moléculaires7. En outre, comme la source de graines, de fruits et de fleurs sont d’une importance primordiale pour la nutrition humaine et animale. Donc, la caractérisation du développement de fleurs et de fruits a de nombreuses implications pour la recherche appliquée, y compris la sécurité alimentaire d’une population croissante et des stratégies de conservation écologique portant une mutation de l’environnement8 , 9 , 10.
Développement floral chez Arabidopsis commence avec l’induction florale et la transformation du méristème végétatif d’un méristème de l’inflorescence (groupe de fleurs). Fleur primordiums latéralement sur le flanc de l’inflorescence méristème11. Les primordia des organes floraux forment progressivement en verticilles concentriques de l’extérieur vers le centre de la fleur et éventuellement se développent en des sépales, pétales, étamines et des carpelles7. Ces organes floraux remplissent distincte nutritive, protectrice et fonctionnelle (par exemple, l’attraction des pollinisateurs) rôles dans différentes espèces de plantes, avec les organes sexuels, soutenir le développement des gamétophytes mâles et femelles, respectivement12 , 13. les gamétophytes, à son tour, chacun différencient une paire de mâles (spermatozoïdes) et des gamètes femelles (oeuf et cellule centrale), qui s’unissent à la double fécondation pour former la prochaine génération, le zygote et l’endosperme primaire, un terminal tissus soutenant le développement de l’embryon14,15. Développement des fruits et semences de soutenir la croissance, la maturation et la conservation de l’embryon et, éventuellement, sa dispersion. Une recherche approfondie a été effectuée pour caractériser la fleur et l’embryon développement dans diverses espèces végétales, en particulier en l’espèce modèle Arabidopsis7,16,17.
Des analyses microscopiques au début du développement floral reposaient sur le traitement des échantillons fastidieux et observation techniques, comme la paraffine ou résine enrobage et sectionnant, combiné avec la lumière ou la microscopie électronique. Ces techniques microscopiques traditionnelles étaient souvent utilisés en combinaison avec des enquêtes génétiques moléculaires, comme les analyses microscopiques de mutants, de la localisation de l’ARN par hybridation in situ ou immuno-détection des protéines. Les progrès récents en microscopie à fluorescence à champ large et confocale, dans les analyses de l’état-of-the-art image assistée par ordinateur en 3D et l’amélioration continue des méthodes moléculaires qui peuvent être utilisés sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à un besoin de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon qui sont préférentiellement se prêtent à des analyses quantitatives. Ces dernières années, des progrès significatifs accomplis dans le développement de techniques de compensation sur les animaux spécimen entier-montent. Ils rendent l’échantillon transparent soit en utilisant des réactifs aqueux ou sucre-base d’urée (p. ex., échelle, SeeDB, cubique)18,19,20, soit en supprimant sélectivement les lipides (en utilisant le détergent SDS) après incorporant des échantillons dans les hydrogels stables ; l’élimination des lipides peut être atteint soit par diffusion passive (p. ex., modification clarté protocole21, Pacte-PARS-jantes22) ou activement par électrophorèse (original clarté protocole23 et24de la loi-PRESTO). Encouragée par ces progrès rapides, certaines techniques dérivées apparaissent également pour utilisation dans les usines.
Dans cet article de méthodes axé sur le modèle Arabidopsis, nous décrivons la procédure pour la dissection correcte des boutons floraux, les fleurs et les siliques jeunes et l’enlèvement des échantillons entiers pour colorer diverses et les procédures d’observation à l’aide classique ou d’une méthode axée sur le SDS clairière récente. Exemples d’amidon, callose et coloration de la chromatine sont donnés. Bien que ces procédures peuvent besoin de plus d’améliorations et adaptations lorsqu’il est utilisé avec d’autres espèces, nous espérons qu’ils préparera le terrain pour des recherches ultérieures sur ces méthodes simples mais essentielles qui constituent le point de départ de nombreux projets de recherche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81910-250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>51198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>69773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77607-250ML</td>
			<td>We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clove oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8392-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4436.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>57665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuchsin acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1047,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6259</td>
			<td>Fluorescent brightener 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>10120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>19-57030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient-rich substrate</td>
			<td>Einheitserde</td>
			<td>ED73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch maker&#39;s glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td>0108-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Plastipak 300013</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Microlance 304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DV40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A plastic box with damp paper towel and slide supports inside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carnoy&#39;s (Farmer&#39;s) fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol/acetic acid fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPA50 fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearing solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate/glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Hoyer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s 4&#189; clearing fluid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS/NaOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combined clearing and staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s IKI-4&#189;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To a standard 4&#189; (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy&#39;s fixative for quantitative starch analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexander staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr&#39;s 4&#189; solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It&#39;s used on freshly harved non-fixed material.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor-Auramine mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy&#39;s and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate buffer (0.1 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques

En raison de sa formidables outils pour les études de génétique moléculaire, Arabidopsis thaliana est une des espèces plus en vue de la modèle en biologie végétale et, surtout, en biologie de la reproduction végétale. Cependant, plante morphologique, anatomique et les analyses ultrastructurales comprennent traditionnellement beaucoup de temps l’incorporation et la section procédures de champ lumineux, balayage et au microscope électronique. Les progrès récents dans la microscopie confocal fluorescence, state-of-the-art 3D analyses microscopiques assistée par ordinateur et l’amélioration continue des techniques moléculaires pour être utilisé sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à une augmentation de la demande pour développement de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon. Dans ce protocole, les auteurs décrivent les techniques de dissection correctement Arabidopsis fleurs et siliques, base de techniques, de compensation et certaines méthodes de coloration pour toute monture observations des structures reproductrices.

Arabidopsis appartient à la famille des Brassicacées, portant des inflorescences avec des fleurs bisexuées, disposées en corymbe (Figure 1). Chaque fleur comporte quatre sépales, quatre pétales, six étamines (quatre de long et deux courts) et un gynécée syncarpe constitué de deux carpelles congénitalement fusionnés (Figure 1F-H) disposées en verticilles concentriques quatre...

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Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Research

JoVE Journal

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Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

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