Name: whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Zurique, um IEF Marie Curie Grant (conceder n. TransEpigen-254797 de A.H.), um avançado Grant do Conselho Europeu de investigação (conceder n. Medea-250358 de U.G.) e um projeto de pesquisa e desenvolvimento tecnológico (grant MecanX de U.G.) de SystemsX.ch, a iniciativa Suíça em biologia de sistemas.

1. a flor e a fixação de síliqua
<ol><li>Colheita de flores e siliques de plantas sincronizados na abertura das primeiras flores. Nota: Nas condições experimentais utilizadas aqui, plantas começam a floração aproximadamente 21 dias após o transplante das placas de Murashige e Skoog (MS) para o solo. As sementes são estratificadas por 3 – 4 dias a 4 ° C e germinadas/cultivadas em placas de MS em 22 ° C/16 h luz e 18 ° C/8 h escura por 8 a 10 dias, antes de transplantar as mudas em solo rico em nutrient...

A existência de muitos botões de flores dentro de um único inflorescência de Arabidopsis, abrangendo todas as fases do desenvolvimento de flor, oferece uma oportunidade única para estudos vista caracterizar um efeito de um tratamento ou uma característica do desenvolvimento simultaneamente em diferentes fases do desenvolvimento da flor. Um ponto de referência boa entre diferentes plantas individuais é a abertura da primeira flor da inflorescência a principal. As plantas são tratadas de forma a que a fl...

Flores estão entre os mais importantes definindo órgãos das angiospérmicas. Plantas apareceu há alguns anos 90 milhões1e diversificou-se tão rápido que sua rápida aparição foi descrita como um "abominável mistério" por Charles Darwin2. Os interesses dos investigadores da planta em desenvolvimento da flor são diversos. Algumas pesquisas centrou-se na compreensão da origem evolutiva da flor como um todo, ou a evolução das propriedades específicas de anatômicas, estruturais e funcionais de flores3,4,5,6 . A alta variação na forma floral e estrutura, bem como os modos de reprodução sexual e assexual, confiando neles, fazer a flor de uma estrutura altamente complexa. Isto levou a diversos esforços para caracterizar as anatomia e características estruturais dos órgãos florais, usando técnicas de microscópica luz e o elétron que poderiam ser combinadas com investigações genéticas e moleculares7. Além disso, como a fonte de frutos e sementes, as flores são de suma importância para a nutrição humana e animal. Portanto, a caracterização de desenvolvimento de flores e frutas tem muitas implicações para a investigação aplicada, incluindo a segurança alimentar de uma população humana crescente e estratégias de conservação ecológica sob uma mudança de ambiente8 , 9 , 10.
Desenvolvimento da flor em Arabidopsis começa com indução de flor e a transformação do meristema vegetativa para uma meristema de inflorescência (grupo de flores). Primordia flor é iniciada lateralmente no flanco do meristema inflorescência11. O primordia órgão floral forma progressivamente em espirais concêntricos de fora para o centro da flor e eventualmente evoluir para sépalas, pétalas, estames e carpelos7. Estes órgãos florais cumprir distinta nutritiva, protetora e funcional (por exemplo, atração de polinizadores) funções em diferentes espécies de plantas, com os órgãos sexuais, sustentando o desenvolvimento de gametófitos masculinos e femininos, respectivamente,12 , 13. os gametófitos, por sua vez, cada diferenciam um par do sexo masculino (esperma) e gametas femininas (ovo e célula central), que unem a dupla fertilização para formar a próxima geração, o zigoto e o endosperma primário, um terminal tecido apoiando o desenvolvimento do embrião14,15. Desenvolvimento de frutos e sementes apoiar o crescimento, maturação e preservação do embrião e, eventualmente, a sua dispersão. Extensas pesquisas tem sido realizada para caracterizar o desenvolvimento de flor e embrião em espécies de plantas diversas, especialmente nas espécies modelo Arabidopsis7,16,17.
Primeiras análises microscópicas de desenvolvimento da flor basearam-se na observação técnicas, tais como a parafina ou resina incorporação e seccionamento, combinado com a luz ou microscopia eletrônica e processamento de amostra demorada. Estas técnicas microscópicas tradicionais eram frequentemente usadas em combinação com as investigações de genéticas moleculares, tais como análises microscópica de mutantes, a localização do RNA por hibridação in situ ou imuno-detecção de proteínas. Recentes progressos em microscopia de fluorescência de campo amplo e confocal, no estado-da-arte em 3D auxiliado por computador imagem análises e o contínuo refinamento dos métodos moleculares que podem ser usados em espécimes de toda a montagem minimamente processados, levou a uma necessidade de técnicas de processamento eficiente e mínimo de amostra que são preferencialmente passíveis de análises quantitativas. Nos últimos anos, tem sido feitos progressos significativos no desenvolvimento de técnicas de compensação em toda a montagem espécime animal. Eles processam a amostra transparente usando reagentes aquosa ou açúcar-à base de ureia (por exemplo, escala, SeeDB, cúbicos)18,19,20, ou removendo seletivamente lipídios (usando o detergente SDS) após incorporação de amostras em hidrogel estável; a remoção de lipídios pode ser alcançado por difusão passiva (por exemplo, modificação clareza protocolo21, pacto-PARS-aros22) ou ativamente por eletroforese (original clareza protocolo23 e PRESTO ACT24). Encorajado por este progresso rápido, também estão surgindo algumas técnicas derivadas para uso em plantas.
Este papel de métodos focado no modelo Arabidopsis, descrevemos o procedimento para a adequada dissecção de botões florais, flores e siliques jovens e a limpeza de toda a montagem amostras para coloração diversa e procedimentos de observação usando clássica ou um recente método de compensação baseada em SDS. Exemplos de amido, callose e mancha de cromatina são dadas. Embora esses procedimentos podem precisar de mais melhorias e adaptações quando usado com outras espécies, esperamos que irão definir o cenário para uma pesquisa mais adicional sobre esses métodos simples, mas essenciais que são o ponto de partida de muitos projetos de pesquisa.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81910-250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>51198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>69773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77607-250ML</td>
			<td>We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clove oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8392-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4436.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>57665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuchsin acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1047,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6259</td>
			<td>Fluorescent brightener 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>10120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>19-57030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient-rich substrate</td>
			<td>Einheitserde</td>
			<td>ED73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch maker&#39;s glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td>0108-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Plastipak 300013</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Microlance 304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DV40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A plastic box with damp paper towel and slide supports inside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carnoy&#39;s (Farmer&#39;s) fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol/acetic acid fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPA50 fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearing solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate/glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Hoyer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s 4&#189; clearing fluid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS/NaOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combined clearing and staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s IKI-4&#189;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To a standard 4&#189; (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy&#39;s fixative for quantitative starch analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexander staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr&#39;s 4&#189; solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It&#39;s used on freshly harved non-fixed material.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor-Auramine mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy&#39;s and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate buffer (0.1 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques

Devido às suas formidáveis ferramentas para estudos de genéticas molecular, Arabidopsis thaliana é uma das espécies modelo mais proeminentes em biologia vegetal e, especialmente, na biologia reprodutiva de plantas. No entanto, planta morfológica, anatômica e análises ultra-estruturais tradicionalmente envolvem a incorporação demorados e procedimentos para campo claro, varredura e microscopia eletrônica de corte. Recentes progressos em microscopia de fluorescência confocal, estado-da-arte em 3D auxiliado por computador análises microscópicas e o refinamento contínuo de técnicas moleculares para ser usado em amostras de toda a montagem minimamente processadas, conduziu a um aumento da demanda por desenvolvimento de técnicas de processamento de amostra mínima e eficiente. Neste protocolo, descrevemos técnicas para corretamente dissecando Arabidopsis flores e siliques, básicos de técnicas, de compensação e alguns procedimentos de coloração para toda montagem observações de estruturas reprodutivas.

Arabidopsis pertence à família Brassicacea, rolamento inflorescências com flores bissexuais, dispostas em uma panícula (Figura 1). Cada flor tem quatro sépalas, pétalas de quatro, seis estames (quatro longas e dois curtas) e um gineceu syncarpous, consistindo de dois congenitamente carpelos (Figura 1F-H) dispostos em quatro verticilos concêntricos25,<sup class="x...

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Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Biologia do Desenvolvimento

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

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Culturas Organotypic tridimensional de órgãos sensoriais auditivas e vestibulares

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

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Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...