Name: high-throughput parallel sequencing to measure fitness of leptospira interrogans transposon insertion mutants during golden syrian hamster infection
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection at JoVE.c

أيد هذا العمل على "جائزة الجدارة شؤون قدامى المحاربين" (إلى D.A.H.)، و "المعهد الوطني للصحة" منح R01 منظمة العفو الدولية 034431 (D.A.H.).

تنبيه: يجب معالجة سلالات ممرضة من Leptospira spp. تحت إجراءات الاحتواء 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2). يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية). ثانيا فئة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء يجب أن يستخدم لجميع المعالجات من الممرضة Leptospira spp.
1-إنشاء ينقو...

<ol>
	<li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species.">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li><li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+leptospirosis:+the+influence+of+genomics.">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li><li>Marcsisin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+high-throughput+screen+to+identify+Leptospira+mutants+unable+to+colonize+the+carrier+host+or+cause+disease+in+the+acute+model+of+infection.">Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection.</a> J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn-seq,+a+high-throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms.">Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).</li><li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+barriers+to+Borrelia+burgdorferi+dissemination+during+infection+using+massively+parallel+sequencing.">Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing.</a> Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).</li><li>Wunder, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+reveals+rapid+dissemination+of+Leptospira+interrogans+after+intraperitoneal+and+conjunctival+inoculation+of+hamsters.">Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters.</a> Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).</li><li>Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+for+studying+the+dissemination+of+Leptospira+interrogans+in+the+guinea+pig+infection+model+of+leptospirosis.">Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis.</a> J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).</li><li>Coutinho, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Leptospira+interrogans+infection+in+hamsters+after+intradermal+and+subcutaneous+challenge.">Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).</li><li>Athanazio, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rattus+norvegicus+as+a+model+for+persistent+renal+colonization+by+pathogenic+Leptospira+interrogans.">Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans.</a> Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).</li><li>Ratet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+bioluminescent+Leptospira+interrogans+in+mice+reveals+renal+colonization+as+a+stealth+escape+from+the+blood+defenses+and+antibiotics.">Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).</li><li>Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+virulence+factors+required+for+respiratory+melioidosis+using+Tn-seq+mutagenesis.">Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).</li><li>Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung.">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li><li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq.">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li><li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon.">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods Mol Biol. 859, (2012).</li><li>Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+transfer+between+Escherichia+coli+and+Leptospira+spp.+as+a+new+genetic+tool.">Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).</li><li>Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+parallel+sequencing+to+measure+fitness+of+Leptospira+interrogans+transposon+insertion+mutants+during+acute+infection.">High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).</li><li>Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrition+of+Leptospirapomona+and+growth+of+13+other+serotypes:+Fractionation+of+oleic+albumin+complex+and+a+medium+of+bovine+albumin+and+polysorbate+80.">Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80.</a> Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).</li><li>Johnson, R. C., Harris, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pathogenic+and+saprophytic+letospires.+I.+Growth+at+low+temperatures.">Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li><li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+(IncW)+and+RP4+plasmid+(IncPa)+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains.">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li><li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScope:+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics.">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021 (2009).</li><li>Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+microbial+fitness+determinants+by+insertion+sequencing+using+genome-wide+transposon+mutant+libraries.">Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries.</a> Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).</li><li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).</li><li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence.">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3 (7), (2007).</li><li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species:+disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis.">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hamster+model+of+leptospirosis.">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).</li><li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis.">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li><li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible,+reproducible,+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences.">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy:+a+web-based+genome+analysis+tool+for+experimentalists.">Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists.</a> Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).</li><li>McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGenTA;+a+Galaxy+implemented+tool+for+complete+Tn-Seq+analysis+and+data+visualization.">MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization.</a> Bioinformatics. , 1367 (2017).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+fitness+landscapes+of+Vibrio+cholerae+at+important+stages+of+its+life+cycle.">Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).</li><li>Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+markers+for+genetic+manipulations+of+Leptospira+spp.">Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Pappas, C. J., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+gene+expression+in+Leptospira+spp.+by+Transcription+activator-like+effectors+demonstrates+a+potential+role+for+LigA+and+LigB+in+Leptospira+interrogans+virulence.">Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).</li><li>Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection-driven+gene+loss+in+bacteria.">Selection-driven gene loss in bacteria.</a> PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).</li><li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Tn-seq+analysis+of+carbohydrate+utilization+and+vertebrate+infectivity+of+Borrelia+burgdorferi.">Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).</li><li>Ramsey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+genetic+screen+identifies+previously+uncharacterized+Borrelia+burgdorferi+genes+important+for+resistance+against+reactive+oxygen+and+nitrogen+species.">A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species.</a> PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).</li></ol>

على الرغم من أن يتم عرض النتائج من لدينا تجربة رائدة لتحدي إينترابيريتونيلي مع 42 إينتيروجانس L. طفرات الهامستر17، ونتوقع أن تجمعات أكبر من طفرات يمكن أن يكون صاحبها ما يليها تينيسي لأن تواتر ترانسكونجوجانتس منخفضة (100-200 ترانسكونجوجانتس/التزاوج)، ماتينجس عدة ضرورية لإنشاء...

من الصعب تحديد الجينات الفوعة لبعض أنواع البكتيريا، مثل Leptospira spp.، بسبب العدد المحدود من الأدوات الجينية المتاحة. أحد النهج استخداماً هو إنشاء مجموعة من طفرات من الطفرات العشوائية ينقول متبوعاً بتحديد موقع الإدراج في كل متحولة واختبار الفوعة طفرات ينقول الفردية في نموذج حيوان. وهذا النهج هو مضيعة للوقت ومكلفة، ويتطلب عدد كبير من الحيوانات.
عندما الطفرات العشوائية وضعت أولاً لمسببات المرض Leptospira إينتيروجانس، حددت الجينات المعنية بضراوة عن طريق اختبار طفرات الفردية في نموذج حيوان1. واختيرت طفرات استناداً إلى معايير مثل أدوارها المحتملة في الإشارات أو حركية أو الغشاء الخارجي المتوقعة أو موقع السطحية. كما أن غالبية ليبتوسبيرال ترميز الجينات البروتينات افتراضية لدالة غير معروفة2، اختيار طفرات استناداً إلى هذه الحدود معايير القدرة على اكتشاف الجينات الفوعة ليبتوسبيرال الرواية.
في الآونة الأخيرة، تم فحص برك طفرات ينقول إينتيروجانس L. للعدوى في نماذج الهامستر والفأر3. وطعن كل الحيوانات مع مجموعة طفرات تصل إلى 10. وكان سجل العدوى متحولة إيجابية لو أنه تم الكشف عن طريق PCR للثقافات التي تم الحصول عليها من الدم والكلى. وكان اختبار PCR شاقة لأنه يتطلب فعل PCR فردية لكل متحولة في حوض السباحة. لأنه كان لم يحدد كمياً تواتر كل متحولة في الثقافات، كان متحيزا النهج نحو تحديد طفرات عالية الموهن.
يصف لنا ينقول التسلسل (Tn-Seq) تقنية، كاستراتيجية للشاشة أكثر كفاءة للجينات الفوعة. تينيسي-seq يتكون من إنشاء مكتبة طفرات من الطفرات ينقول متبوعاً تسلسل المتوازية الضخمة4،،من56. بإيجاز، تجميع طفرات ينقول وطعمت في الحيوانات واستردادها في وقت لاحق من أجهزة مختلفة (مجمعات الإنتاج). استخراج الحمض النووي من مجمعات الإنتاج ويهضم مع إنزيمات التقييد أو المنفصمة ب sonication. يتم إجراء جولتين من PCR استهداف وصلات مواقع الإدراج ينقول. هذه الخطوة يمكن إضافة المحولات اللازمة للتسلسل. ويتم تحليل منتجات PCR الناتجة بالتسلسل الفائق لتحديد موقع الإدراج ينقول كل متحولة تجمع جنبا إلى جنب مع هذه الوفرة النسبية، الذي هو مقارنة مع التكوين الأولى لمجمع المسخ.
الميزة الرئيسية لهذا النهج هو القدرة على الشاشة في نفس الوقت عدد كبير من طفرات مع عدد قليل من الحيوانات. تينيسي-Seq لا تتطلب معرفة مسبقة من مواقع الإدراج ينقول مما يزيد من فرص اكتشاف جديد Leptospira-جينات معينة تشارك في الفوعة بأقل وقت وقدر أكبر من الكفاءة. نظراً للعبء ليبتوسبيرال في أنسجة مرتفع نسبيا في القوارض نماذج العدوى عرضه لقاتله (عادة 104 إلى 108 البكتيريا/غرام من الأنسجة)7،،من89 كذلك كما هو الحال في مستودعات مضيفة 10،11، يمكن تحليل الأنسجة مباشرة دون الحاجة إلى الثقافة والحد من التحيز بسبب النمو في المختبر .
في تينيسي Seq الدراسات مع معظم مسببات الأمراض البكتيرية ووصف حتى الآن، سمح عالية التردد من الطفرات insertional العدوى مع تجمعات كبيرة تحتوي على طفرات جماعياً بعد غرز متباعدة عن كثب ينقول متعددة داخل كل الجينات4 ،،من1213،14. كما وضعت Tn Seq لبكتيريا التي تردد الطفرات هو كثير أقل من6. مع Leptospira، يمكن إنشاء مكتبة طفرات ينقول بإدخال ينقول على بلازميد متمركزة بالاقتران كما هو موضح سلامتي وآخرون15. ومع ذلك، تواتر الطفرات ينقول لام إينتيروجانس منخفض. عندما ينقول Himar1 أدخل على بلازميد كونجوجاتيفي، تواتر ترانسكونجوجانت أفيد بأن الخلية مع الضغط لأي من إينتيروجانس ل16 فقط 8.5 × 10-8 كل مستلم ومن المرجح أن تكون وبالمثل الفقيرة مع معظم السلالات الأخرى لام إينتيروجانس. بروتوكول الموصوفة هنا في جزء على أساس أن البلدان المتقدمة النمو البورليه burgdorferi، الذي هو أيضا تواتر الطفرات insertional ينقول منخفضة6.
لدينا تجربة رائدة مع بروتوكول17، أجرينا الطفرات ينقول مع إينتيروجانس L. سرفار مانيلا سلالة L495 بسبب نجاح الفئات الأخرى في عزل ينقول الإدراج طفرات في سلالة جنبا إلى جنب مع انخفاض LD50 (جرعة مميتة) لضراوة1. نحن فحص طفرات 42 من تينيسي-Seq وحددت العديد من المرشحين متحولة معيبة في الفوعة، بينهم اثنان مع الملاحق في جين adenylate cyclase مرشح. وأكدت التجارب الفردية من طفرات اثنين في الهامستر أن كانت قاصرة في الفوعة17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>490950-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy blood and tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504/69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004/28006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104/28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 505 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Cup horn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Ruptor 24</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Step 3.1.2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal deoxynucleotidyl transferase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M828C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mix Phusion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F531</td>
			<td>Preparation of genomic libraries, step 3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K9011/K9012</td>
			<td>Identification of the transposon insertion site, step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddCTP</td>
			<td>Affymetrix/ USBProducts</td>
			<td>77112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851/Q32854</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-027 20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel No10</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic K2 EDTA 2 ml tubes</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>367841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe U-100 with 26G x &#189;&#8221; needle</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>329652</td>
			<td>IP challenge, step 2.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>309657</td>
			<td>Cardiac puncture, step 2.4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G X 5/8&#8221; needle</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>305901</td>
			<td>Cardiac puncture, step 2.4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm fritted glass base with stopper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002502</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm aluminum spring clamp</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002503</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml borosilcate glass funnel</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002514</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 ml side-arm Erlenmeyer flask</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002505</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VVLP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput parallel sequencing to measure fitness of leptospira interrogans transposon insertion mutants during golden syrian hamster infection

في هذه المخطوطة، يصف لنا ينقول التسلسل (Tn-Seq) تقنية لتحديد وتقدير حجم Leptospira إينتيروجانس طفرات غيرت في اللياقة البدنية خلال عدوى الهامستر السوري الذهبي. تينيسي-Seq يجمع بين الطفرات ينقول عشوائي مع قوة تكنولوجيا التسلسل الفائق. وتحدي الحيوانات مع مجموعة من ينقول طفرات (تجمع الإدخال)، متبوعاً بحصاد الدم والأنسجة بضعة أيام في وقت لاحق لتحديد وقياس عدد طفرات في كل جهاز (مجمعات الإنتاج). تتم مقارنة في تجمعات الإخراج إلى تجمع الإدخال لتقييم اللياقة في فيفو كل متحولة. ويتيح هذا النهج فحص مجموعة كبيرة من طفرات في عدد محدود من الحيوانات. مع تعديلات طفيفة، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مع أي نموذج من نماذج حيوانية لداء البريميات، وخزان المضيف نماذج مثل الفئران، ونماذج الإصابة الحادة مثل الهامستر، فضلا عن الدراسات في المختبر . تينيسي-Seq يوفر أداة قوية للشاشة لطفرات بعيوب اللياقة البدنية في الجسم الحي وفي المختبر .

إنشاء مكتبة طفرات ينقول في إينتيروجانس L. بالاقتران يتطلب وحدة ترشيح، كما هو مبين في الشكل 1. أننا تعافي ترانسكونجوجانتس 100-200 من كل التزاوج.
يتم تحديد موقع الإدراج ينقول في كل متحولة حسب تسلسل المنتج بكر ولده بكر شبه عش...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection at JoVE.c

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

يصف لنا هنا أسلوب الذي يجمع بين الطفرات ينقول مع التسلسل الفائق لتحديد وتقدير حجم ينقول ليبتوسبيرال طفرات في الأنسجة بعد تحديا الهامستر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لطفرات الشاشة للبقاء على قيد الحياة، ونشر في الحيوانات، ويمكن تطبيقها أيضا على الدراسات في المختبر .

التسلسل الفائق موازية "قياس اللياقة البدنية" الإصابة إينتيروجانس Leptospira ينقول الإدراج طفرات خلال الذهبي السوري الهامستر

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

تحديد التربة المنقولة الإصابة بالديدان الحالة واللياقة البدنية من الأطفال في سن المدرسة

Soil-transmitted helminth (STH) infections are common. Indeed, more than 1 billion people are affected, mainly in the developing world where poverty ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

بناء الطفرات في سلالة العقدية الرئوية من النمط المصلي 1 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...