Name: high-throughput parallel sequencing to measure fitness of leptospira interrogans transposon insertion mutants during golden syrian hamster infection
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection at JoVE.c

Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Veterans Affairs Merit Award (für D.A.H.) und eine National Institute of Health gewähren R01 AI 034431 (D.A.H.).

Achtung: Pathogene Stämmen von Leptospira SPP müssen unter Biosafety Level 2 (BSL-2) Containment Verfahren behandelt werden. Geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden. Ein Klasse II Biosicherheit Kabinett zwingend erforderlich alle Manipulationen von pathogenen Leptospira spp.
1. Erstellung der das Transposon mutierten Bibliothek15
<ol><li>
Transfer von das Transposon in Leptospira Spp. durch Ko...

<ol>
	<li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species.">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li><li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+leptospirosis:+the+influence+of+genomics.">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li><li>Marcsisin, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+reveals+rapid+dissemination+of+Leptospira+interrogans+after+intraperitoneal+and+conjunctival+inoculation+of+hamsters.">Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters.</a> Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).</li><li>Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+real-time+PCR+for+studying+the+dissemination+of+Leptospira+interrogans+in+the+guinea+pig+infection+model+of+leptospirosis.">Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis.</a> J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).</li><li>Coutinho, M. 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Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li><li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+(IncW)+and+RP4+plasmid+(IncPa)+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains.">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li><li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScope:+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics.">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021 (2009).</li><li>Goodman, A. 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Zwar ergibt sich aus unseren Pilotversuch für Hamster mit 42 L. Interrogans Mutanten intraperitoneal herausgefordert17präsentiert werden, erwarten wir, dass größere Pools von Mutanten durch Tn-FF abgeschirmt werden können Da die Frequenz der Transconjugants niedrig ist (100-200 Transconjugants/Paarungen), mehrere Paarungen sind notwendig, um eine ausreichende Anzahl von Mutanten für große Tn-Seq-Experimente zu erzeugen. Eine große Anzahl von Mutanten in flüssigen Kulturen pflegen...

Identifizierung von Genen Virulenz für manche Bakterien, wie z. B. Leptospira spp., ist schwierig, wegen der begrenzten Zahl der genetischen Werkzeuge zur Verfügung. Eine häufig verwendete Methode ist die Erstellung einer Sammlung von Mutanten durch zufällige Transposon Mutagenese, gefolgt von der Identifikation der Insertionsstelle in jeder Mutant und Virulenz von einzelnen Transposon Mutanten in einem Tiermodell testen. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig, teuer und erfordert eine große Anzahl von Tieren.
Als zufällige Mutagenese zunächst für den Erreger Leptospira Interrogansentwickelt wurde, wurden an Virulenz beteiligten Gene identifiziert, durch die Prüfung einzelner Mutanten in einem Tiermodell1. Mutanten wurden basierend auf Kriterien wie ihre mögliche Rolle bei der Signalisierung oder Motilität oder ihrer vorhergesagten Außenmembran oder Oberfläche Speicherort ausgewählt. Da die Mehrzahl der Leptospiral Gene kodieren hypothetischen Proteine der unbekannten Funktion2, Auswahl durch Mutation entstehende Variationen anhand dieser Kriterien Grenzen die Möglichkeit, neuartige Leptospiral Virulenz Gene zu entdecken.
Pools von L. Interrogans Transposon Mutanten wurden in jüngerer Zeit, für die Infektiosität in der Hamster und Maus Modelle3gezeigt. Jedes Tier wurde mit einem Pool von bis zu 10 Mutanten in Frage gestellt. Infektiosität einer Mutante erzielte er als positiv, wenn sie durch PCR Kulturen gewonnenen Blut und Niere festgestellt worden. PCR-Tests war mühsam, weil es eine individuelle PCR-Reaktion für jede Mutante im Pool erforderlich. Da die Frequenz jeder Mutant in den Kulturen nicht quantifiziert wurde, war der Ansatz zur Identifizierung von stark abgeschwächte Mutanten voreingenommen.
Wir beschreiben ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik, als eine Strategie, um effizienter Bildschirm für Virulenz Gene. TN-Seq besteht aus der Erstellung einer Bibliothek von Mutanten durch Transposon Mutagenese gefolgt von massiven parallelen Sequenzierung4,5,6. Transposon Mutanten sind kurz, gebündelt, in die Tiere geimpft und später erholte sich von verschiedenen Organen (Ausgabe Pools). Die DNA von den Ausgabe-Pools wird extrahiert und mit Restriktionsenzymen verdaut oder durch Ultraschallbehandlung geschert. Zwei Runden von PCR gezielt die Kreuzungen der Transposon Einfügung Seiten erfolgen. Dieser Schritt ermöglicht die Zugabe von den Adaptern für die Sequenzierung erforderlich. Die daraus resultierende PCR-Produkte werden von Hochdurchsatz-Sequenzierung Transposon Insertionsstelle jede Mutante des Pools zusammen mit ihrer relativen Fülle, zu identifizieren, die im Vergleich zu der ursprünglichen Zusammensetzung der Pool der Mutant analysiert.
Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, gleichzeitig eine große Anzahl von Mutanten mit einer kleinen Anzahl von Tieren auf den Bildschirm. TN-Seq erfordert keine Vorkenntnisse der Transposon Einfügung Websites die erhöht die Chancen der Entdeckung neuer Leptospiren-spezifischen Genen in Virulenz mit weniger Zeit und mehr Effizienz. Weil Leptospiral Belastung im Gewebe relativ hoch in Nagetier-Modelle anfällig für tödliche Infektion (in der Regel 104 108 Bakterien/g Gewebe)7,8,9 ebenso wie Reservoirwirten 10,11, Gewebe direkt analysiert werden können, ohne die Notwendigkeit, Kultur, Verringerung der Verzerrungen durch in-vitro- Wachstum.
In Tn-Seq-Studien mit den meisten bakteriellen Erregern, die bisher beschrieben erlaubt die hohe Frequenz der insertional Mutagenese Infektion mit großen Pools mit Mutanten, die gemeinsam mit mehreren eng beieinander liegender Transposon Einfügungen innerhalb jedes Gen4 ,12,13,14. TN-Seq wurde auch für ein Bakterium entwickelt für die Mutagenese-Frequenz viel niedriger6 ist. Mit Leptospirakann eine Bibliothek von Transposon Mutanten erzeugt werden, durch die Einführung des Transposons auf ein konduktiven Plasmid durch Konjugation wie von Slamti Et Al15beschrieben. Die Häufigkeit der Transposon Mutagenese von L. Interrogans ist jedoch gering. Wenn das Transposon Himar1 auf ein konjugative Plasmid eingeführt wurde, wurde die Transconjugant Häufigkeit berichtet, nur 8,5 x 10-8 pro Empfänger mit der Lai-Belastung von L. Interrogans16 Zelle und wird voraussichtlich ähnlich schlecht mit den meisten anderen Sorten von L. Interrogans. Das hier beschriebene Protokoll ist im Teil auf der Grundlage, die für Borrelia Burgdorferi, entwickelt in denen die Häufigkeit von Transposon insertional Mutagenese ist auch niedrig6.
Für unsere Pilotversuch mit der Protokoll-17führten wir Transposon Mutagenese mit L. Interrogans Serovar Manilae Stamm L495 aufgrund des Erfolges der anderen Gruppen isolieren Transposon Einfügung Mutanten in den Stamm zusammen mit seinem tief LD50 (letale Dosis) für Virulenz1. Wir 42 Mutanten durch Tn-Seq abgeschirmt und identifiziert mehrere mutierte Kandidaten in Virulenz, darunter zwei mit Einfügungen in einem Kandidaten-Adenylat-Cyclase-gen defekt. Einzelprüfung der beiden Mutanten in Hamster bestätigt, dass sie einen Mangel an Virulenz17waren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>490950-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy blood and tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504/69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004/28006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104/28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 505 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Cup horn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Ruptor 24</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Step 3.1.2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal deoxynucleotidyl transferase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M828C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mix Phusion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F531</td>
			<td>Preparation of genomic libraries, step 3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K9011/K9012</td>
			<td>Identification of the transposon insertion site, step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddCTP</td>
			<td>Affymetrix/ USBProducts</td>
			<td>77112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851/Q32854</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-027 20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel No10</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic K2 EDTA 2 ml tubes</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>367841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe U-100 with 26G x &#189;&#8221; needle</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>329652</td>
			<td>IP challenge, step 2.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>309657</td>
			<td>Cardiac puncture, step 2.4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G X 5/8&#8221; needle</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>305901</td>
			<td>Cardiac puncture, step 2.4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm fritted glass base with stopper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002502</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm aluminum spring clamp</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002503</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml borosilcate glass funnel</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002514</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 ml side-arm Erlenmeyer flask</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002505</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VVLP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput parallel sequencing to measure fitness of leptospira interrogans transposon insertion mutants during golden syrian hamster infection

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik zu identifizieren und quantifizieren Leptospira Interrogans Mutanten in Fitness während der Infektion von syrischen Goldhamster verändert. TN-Seq kombiniert mit der Kraft der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie zufällige Transposon Mutagenese. Tiere sind gefordert, mit einem Pool von Transposon Mutanten (Eingang Schwimmbad), gefolgt von der Gewinnung von Blut und Gewebe ein paar Tage später zu identifizieren und zu quantifizieren, die Anzahl der Mutanten in jedes Organ (Ausgabe Pools). Die Ausgabe-Pools sind gegenüber den Eingang Pool, der in Vivo -Fitness jeden Mutante zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht Screening von einem großen Pool von Mutanten in einer begrenzten Anzahl von Tieren. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll mit jeder Tiermodell der Leptospirose, Reservoir Host wie Ratten und akute Infektionsmodelle wie Hamster, sowie in-vitro- Studien durchgeführt werden. TN-Seq ist ein leistungsstarkes Tool zum Bildschirm für Mutanten mit in Vivo und in Vitro Fitness Mängel.

Aufbau einer Bibliothek von Transposon Mutanten in L. Interrogans durch Konjugation erfordert eine Filteranlage, wie in Abbildung 1dargestellt. Von jeder Paarung erholt wir 100-200 Transconjugants.
Transposon Insertionsstelle in jeder Mutant durch Sequenzierung das PCR-Produkt erzeugt durch semi-random PCR, die zum Jahresende das Transposon Ziel identifiziert und angrenzenden Host-Sequenzen...

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High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Wir beschreiben hier eine Technik, die verbindet Transposon Mutagenese mit Hochdurchsatz-Sequenzierung zu identifizieren und quantifizieren Transposon Leptospiral Mutanten im Gewebe nach einem Zweikampf von Hamstern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bildschirm Mutanten für überleben und Verbreitung bei Tieren und kann auch auf in-vitro- Studien angewendet werden.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

Bestimmung Boden übertragenen Wurminfektionen Status und körperliche Fitness der School-Aged Children

Soil-transmitted helminth (STH) infections are common. Indeed, more than 1 billion people are affected, mainly in the developing world where poverty ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

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Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...