Name: high-throughput parallel sequencing to measure fitness of leptospira interrogans transposon insertion mutants during golden syrian hamster infection
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection at JoVE.c

이 작품 재향 군인 업무 공로 수상 (D.A.H.)에 의해 지원 되었다 그리고 건강의 국립 연구소는 부여 R01 AI 034431 (D.A.H.).

주의: Leptospira 종의 병원 성 긴장 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 견제 절차에 따라 처리 되어야 합니다. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다. 캐비닛 클래스 II biosafety 병원 성 Leptospira 종의 모든 조작에 대 한 사용 해야 합니다.
1. 창조는 Transposon의 돌연변이 도서관15
<ol><li>
활용 하 여 Leptospira spp. 에 transposon의 전송 (...

<ol>
	<li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species.">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li><li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+leptospirosis:+the+influence+of+genomics.">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li><li>Marcsisin, R. 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Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li><li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+(IncW)+and+RP4+plasmid+(IncPa)+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains.">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li><li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroScope:+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics.">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021 (2009).</li><li>Goodman, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. 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Intraperitoneally 42 L. interrogans 돌연변이 함께 도전 하는 햄스터에 대 한 우리의 파일럿 실험 결과17제공 됩니다, 하지만 우리는 돌연변이의 더 큰 수영장 Tn이 의해 상영 될 수 있습니다 기대 Transconjugants의 주파수는 낮은 때문에 (100-200 transconjugants/짝짓기), 몇몇 matings 큰 Tn-Seq 실험에 대 한 돌연변이의 충분 한 번호를 생성할 필요가 있습니다. 액체 문화에서 돌연변이의 많은 수...

Leptospira 종 등 일부 박테리아에 대 한 독성 유전자의 유전 도구 사용할 수 있는 제한 된 수 때문에 어렵습니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 각 돌연변이에 삽입 사이트의 식별 및 독성 테스트 동물 모델에서 개별 transposon 돌연변이의 임의의 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 컬렉션의 창조 이다. 이 방법은 소모, 비싼, 고 동물의 많은 수를 요구 한다.
무작위 mutagenesis Leptospira interrogans병원 체에 대 한 처음으로 개발, 유전자 독성에 관련 된 동물 모델1에서 개별 돌연변이 테스트 하 여 확인 되었다. 돌연변이 신호에 그들의 잠재적인 역할 또는 운동 성 또는 그들의 예상된 외부 막 또는 표면 위치 같은 기준에 따라 선정 됐다. Leptospiral의 대부분으로 유전자 인코딩 알 수 없는 함수2의 가상 단백질, 선택 돌연변이 이러한 조건 제한에 따라 소설 leptospiral 독성 유전자를 발견 하는 능력.
더 최근에, L. interrogans transposon 돌연변이의 풀 infectivity 햄스터와 마우스 모델3에 대 한 상영 했다. 각 동물 수영장 최대 10 돌연변이에 전했다. 돌연변이의 infectivity 문화의 혈액과 신장에서 얻은 PCR에 의해 검색 된 경우 긍정적으로 득점 했다. 수영장에서 각 돌연변이 대 한 개별 PCR 반응 필요 하기 때문에 PCR 테스트 하는 것은 힘 드는. 문화에 각 돌연변이의 주파수는 계량 하지, 때문에 접근 했다 높은 감쇠 돌연변이의 id 쪽으로 치우친 다.
(테네시-Seq) 기법, 독성 유전자에 대 한 화면을 보다 효율적으로 하는 전략으로 시퀀싱 하는 transposon을 설명 합니다. 대규모 병렬 시퀀싱4,,56다음 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 도서관의 창조 테네시-seq에 의하여 이루어져 있었다. 간단히, transposon 돌연변이 풀링된, 동물에 주사 고 나중 다른 장기 (출력 풀)에서 복구. 출력 풀에서 DNA 추출 및 금지 효소로 소화 또는 쥡니다에 의해 전단. 2 라운드 PCR transposon 삽입 사이트의 접속을 대상으로 수행 됩니다. 이 단계는 시퀀싱에 필요한 어댑터의 추가 수 있습니다. 결과 PCR 제품의 그들의 관계 되는 풍부, 돌연변이의 수영장의 초기 구성에 비해 함께 수영장의 각 돌연변이 transposon 삽입 사이트를 식별 하려면 높은 처리량 연속 분석 된다.
이 방법의 주요 장점은 많은 동물의 작은 수로 돌연변이 동시에 화면을 기능입니다. 테네시-Seq 새로운 Leptospira발견의 기회를 증가 하는 transposon 삽입 사이트의 사전 지식이 필요 하지 않습니다-특정 유전자 독성에 더 적은 시간 및 더 큰 효율성과 관련된. 설치류 모델에 치명적인 감염 감염 조직에 leptospiral 부담에서 상대적으로 높기 때문에 (일반적으로 104 조직의 108 박테리아/g)7,,89 또한 저수지 호스트 에서 10,11, 조직 문화, 생체 외에서 성장으로 인해 편견을 줄일 필요 없이 직접 분석 될 수 있다.
테네시-Seq 날짜를 설명 하는 대부분 세균성 병원 체 연구, insertional mutagenesis의 높은 주파수 통칭 데 모든 유전자4 내 여러 긴밀 한-간격 transposon 삽입 돌연변이 포함 하는 큰 풀과 감염을 허용 ,12,,1314. 또한 테네시-Seq는 mutagenesis 주파수는 훨씬 낮은6박테리아에 대 한 개발 되었습니다. Leptospira, 함께 transposon 돌연변이의 라이브러리 활용 설명 된 대로 Slamti 외15여 의해 transposon mobilizable 플라스 미드에 도입 하 여 생성할 수 있습니다. 그러나, L. interrogans 의 transposon mutagenesis의 주파수가 낮습니다. Transconjugant 주파수만 8.5 받는 당 10-8 x L. interrogans16 라이 긴장으로 세포와 될 것입니다 알려졌다 Himar1 transposon conjugative 플라스 미드에 도입 되었다, L. interrogans의 대부분 다른 종자와 마찬가지로 가난한 사람 여기에 설명 된 프로토콜 보렐 리아 burgdorferi는 transposon insertional mutagenesis의 주파수는 또한 낮은6에 대 한 개발에 기반 하는 부분 이다.
프로토콜17우리의 파일럿 실험에 대 한 낮은 함께 피로 transposon 삽입 돌연변이 고립 시키는에 다른 그룹의 성공 때문에 L. interrogans serovar Manilae 긴장 L495와 transposon mutagenesis 실시 LD50 (치명적인 복용량) 독성1. 우리 테네시-Seq에 의해 42 돌연변이 검사 하 고 여러 돌연변이 후보 후보 adenylate 있고 유전자에서 2 삽입을 포함 한 독성에 결함을 발견. 햄스터에 두 돌연변이의 개별 테스트 그들이 결핍 독성17에 확인.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,6-diaminopimelic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>490950-001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy blood and tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504/69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004/28006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104/28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 505 Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5&#34; Cup horn</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Ruptor 24</td>
			<td>Omni International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Step 3.1.2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal deoxynucleotidyl transferase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M828C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master mix Phusion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F531</td>
			<td>Preparation of genomic libraries, step 3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K9011/K9012</td>
			<td>Identification of the transposon insertion site, step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCTP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddCTP</td>
			<td>Affymetrix/ USBProducts</td>
			<td>77112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851/Q32854</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>step 3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-027 20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable scalpel No10</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic K2 EDTA 2 ml tubes</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>367841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe U-100 with 26G x &#189;&#8221; needle</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>329652</td>
			<td>IP challenge, step 2.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Luer-Lok tip syringe</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>309657</td>
			<td>Cardiac puncture, step 2.4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G X 5/8&#8221; needle</td>
			<td>BD vacutainer</td>
			<td>305901</td>
			<td>Cardiac puncture, step 2.4.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm fritted glass base with stopper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002502</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm aluminum spring clamp</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002503</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml borosilcate glass funnel</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002514</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 ml side-arm Erlenmeyer flask</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>XX1002505</td>
			<td>Filtration unit system, step 1.1.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VVLP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput parallel sequencing to measure fitness of leptospira interrogans transposon insertion mutants during golden syrian hamster infection

이 원고에서 우리는 transposon 시퀀싱 (Tn-Seq) 기술을 식별 하 고 계량 Leptospira interrogans 돌연변이 피트 니스 시리아 황금 햄스터의 감염 시 변경 설명 합니다. 테네시-Seq 임의의 transposon mutagenesis 높은 처리량 시퀀싱 기술의 힘 결합합니다. 동물 뒤에 수확 혈액과 조직의 몇 일 후 식별 하 고 각 기관 (출력 풀)에 있는 돌연변이의 수를 계량 transposon 돌연변이 (입력된 풀)의 수영장 도전입니다. 출력 풀 각 돌연변이의 vivo에서 적합성을 평가 하는 입력에 비교 됩니다. 이 방법은 돌연변이 동물의 제한 된 수에서의 대형 수영장의 수 있습니다. 사소한 수정이 프로토콜 렙의 어떤 동물 모델, 저수지 호스트 모델 쥐, 햄스터, 생체 외에서 연구 등 급성 감염 모델 수행할 수 있습니다. 테네시-Seq vivo에서 그리고 생체 외에서 피트 니스 결함 돌연변이 대 한 화면에 강력한 도구를 제공합니다.

그림 1에서 보듯이 transposon 돌연변이 L. interrogans 에 활용 하 여 도서관의 창조 여과 장치를 요구 한다. 우리는 각 짝짓기에서 100-200 transconjugants를 복구.
Transposon 삽입 사이트는 transposon의 끝을 대상으로 어느 정도 임의적인 PCR에 의해 생성 된 PCR 제품을 시퀀싱으로 각 돌연변이에 식별 되 고 인접 한 ...

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High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

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연구

면역학 및 감염병학

Determining Soil-transmitted Helminth Infection Status and Physical Fitness of School-aged Children

결정 토양을 전송 기생충 감염 현황 및 학교 세 어린이의 물리적 휘트니스

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Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

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주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

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High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...