Name: alternative in vitro methods for the determination of viral capsid structural integrity
Uploaded: 2017-11-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity at JoVE.com

Detta arbete stöds av jordbruk och livsmedel forskning initiativ konkurrenskraftiga bidrag nr 2011-68003-30395 från Förenta staternas Department of Agriculture, nationella institutet för livsmedel och jordbruk genom projektet NoroCORE. Finansiering för öppen tillgång avgift lämnades av United States Department of Agriculture. Vi vill tacka Robert Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) för vänligt att ge oss den renade förhoppningsvis och Valerie Lapham för hennes hjälp med TEM bilder. Vi vill också tacka Frank N. Barry för att hjälpa oss börjar de experiment som presenteras.

1. plattan-baserade bindande test för utvärdering av förlust av högre ordning Norovirus kapsid struktur Obs: en mycket liknande ELASA protokollet till den som presenteras här har varit publicerad 29, och liknande ELASA analyser har tidigare rapporterats som del av forskning artiklar någon annanstans 17 , 18 , 22.
<ol><li>Värmebehandling av humana noroviru...

<ol>
	<li>Kirk, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Health+Organization+estimates+of+the+global+and+regional+disease+burden+of+11+foodborne+bacterial,+protozoal,+and+viral+diseases,+2010:+A+data+synthesis.">World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis.</a> PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).</li><li>Scharff, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+burden+from+health+losses+due+to+foodborne+illness+in+the+United+States.">Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States.</a> J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).</li><li>Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+impact+of+outbreaks+of+norovirus+infection+in+hospitals.">Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals.</a> Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).</li><li>Law, J. W. -. F., Ab Mutalib, N. -. S., Chan, K. -. G., Lee, L. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+methods+for+the+detection+of+foodborne+bacterial+pathogens:+principles,+applications,+advantages+and+limitations.">Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations.</a> Front. Microbiol. 5, 770 (2015).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346 (6210), 755-759 (2014).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell+-+derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids.</a> Science. 5211, (2016).</li><li>Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+as+a+foodborne+pathogen:+challenges+and+developments.">Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments.</a> Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).</li><li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-blood+group+antigen-like+substances+of+human+enteric+bacteria+as+specific+adsorbents+for+human+noroviruses.">Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses.</a> J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).</li><li>Almand, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+binding+to+select+bacteria+representative+of+the+human+gut+microbiota.">Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota.</a> Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).</li><li>Rubio-del-Campo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noroviral+P-Particles+as+an+in+vitro+model+to+assess+the+interactions+of+noroviruses+with+probiotics.">Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics.</a> PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).</li><li>Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ELISA+attachment+and+infectivity+assays+for+murine+norovirus.">Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus.</a> J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).</li><li>Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+infectious+and+non-infectious+human+norovirus+using+porcine+gastric+mucin.">Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin.</a> Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).</li><li>Li, X., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+porcine+gastric+mucin+binding+assay+for+high-pressure-inactivation+studies+using+murine+norovirus+and+Tulane+virus.">Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).</li><li>Lou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+inactivation+of+human+norovirus+virus-like+particles+provides+evidence+that+the+capsid+of+human+norovirus+is+highly+pressure+resistant.">High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).</li><li>Wang, D., Tian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+conditions+for+human+norovirus+measured+by+an+in+situ+capture-qRT-PCR+method.">Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method.</a> Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).</li><li>Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+in+situ+capture+quantitative+(real-time)+reverse+transcription-PCR+method+as+an+alternative+approach+for+determining+inactivation+of+Tulane+virus.">New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).</li><li>Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+norovirus+aptamer+exhibits+high+degree+of+target+conformation-dependent+binding+similar+to+that+of+receptors+and+discriminates+particle+functionality.">Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality.</a> mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).</li><li>Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+nucleic+acid+aptamers+targeting+the+capsid+P+domain+of+a+human+norovirus+GII.4+strain.">Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain.</a> J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).</li><li>Kitamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-Reactivity+among+Several+Recombinant+Calicivirus+Virus-Like+Particles+(VLPs)+with+Monoclonal+Antibodies+Obtained+from+Mice+Immunized+Orally+with+One+Type+of+VLP.">Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP.</a> J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).</li><li>Giamberardino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+norovirus+detection+using+DNA+aptasensor+technology.">Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology.</a> PloS one. 8 (11), e79087 (2013).</li><li>Beier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+DNA+aptamer+against+norovirus+capsid+protein+VP1.">Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1.</a> FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).</li><li>Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection,+characterization+and+application+of+nucleic+acid+aptamers+for+the+capture+and+detection+of+human+norovirus+strains.">Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains.</a> PloS one. 9 (9), e106805 (2014).</li><li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not?.">DLS and zeta potential - What they are and what they are not?.</a> Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).</li><li>Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+sizing+methods+for+the+detection+of+protein+aggregates+in+biopharmaceuticals.">Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals.</a> Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).</li><li>Mattle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+virus+aggregation+on+inactivation+by+peracetic+acid+and+implications+for+other+disinfectants.">Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants.</a> Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).</li><li>Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeta+potential+and+aggregation+of+virus-like+particle+of+human+norovirus+and+feline+calicivirus+under+different+physicochemical+conditions.">Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions.</a> Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).</li><li>Mertens, B. S., Velev, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+matter+norovirus+interactions.">Soft matter norovirus interactions.</a> Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).</li><li>Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+amorphous+aggregation+of+tobacco+mosaic+virus+coat+protein+by+dynamic+light+scattering.">The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering.</a> Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).</li><li>Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Enzyme-Linked+Aptamer+Sorbent+Assay+to+Evaluate+Aptamer+Binding.">An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding.</a> Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).</li><li>Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH+on+plaque+forming+unit+counts+and+aggregation+of+MS2+bacteriophage.">Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage.</a> J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).</li><li>Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destruction+of+the+Capsid+and+Genome+of+GII.4+Human+Norovirus+Occurs+during+Exposure+to+Metal+Alloys+Containing+Copper.">Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).</li><li>Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+murine+norovirus+on+a+range+of+copper+alloy+surfaces+is+accompanied+by+loss+of+capsid+integrity.">Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2014).</li><li>Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+disinfectant+containing+silver+dihydrogen+citrate+against+GI.6+and+GII.4+human+norovirus.">Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus.</a> J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+human+norovirus+using+chemical+sanitizers.">Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers.</a> Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).</li><li>Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+Tulane+virus,+a+novel+surrogate+for+the+human+norovirus.">Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus.</a> J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).</li><li>Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+studies+on+binding-based+RT-PCR+detection+of+infectious+noroviruses.">Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses.</a> J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).</li></ol>

Protokoll och tekniker som beskrivs här ger ett sätt att bedöma människors norovirus kapsid integritet/funktionalitet. Dessa metoder kan användas för att erhålla mekanistisk insikt effekterna av inaktivering behandlingar mot viruset, och potentiellt kan komplettera mer traditionella inaktivering utvärderingsmetoder som RT-qPCR eller plack assay. Till exempel ger utvärdering av kemiska eller fysiska inaktivering av plack assay ensam ett mått på graden av virus inaktivering men inte den underliggande mekanismen ...

Humana norovirus ansvarar för en betydande folkhälsa börda globalt, orsakar ca 685 miljoner sjukdomar och 212 000 dödsfall årligen1, till en kostnad i miljarder dollar2,3. Idag, innebär norovirus detektering och kvantifiering genomet förstärkning och/eller ligand-baserade plattformar. Den förstnämnda är generellt att föredra eftersom den är mer känslig, ger kvantitativ information och har generellt lägre risk för falskt positiva resultat4. Den vanligaste norovirus detektering och kvantifiering genomet amplifiering är omvänt transkriptas kvantitativa polymeraskedjereaktion (RT-qPCR). Eftersom den riktar och förstärker ett litet segment av det humana norovirus genomet, RT-qPCR ensam kan inte diskriminera mellan smittsamma och icke-infektiös partiklar, som gratis genomisk RNA, skadade förhoppningsvis som innehåller arvsmassan, och förhoppningsvis med dödligt muterat/trunkerade genomen kan fortfarande förstärkas av RT-qPCR. Medan två nya in vitro- odlingstekniker för humana norovirus5,6 har rapporterats nyligen, båda fortfarande lita på RT-qPCR för virus kvantifiering och ännu inte är genomförbara metoder för rutinmässig klinisk och miljömässiga testning för humana Norovirus. RT-qPCR förblir således guldmyntfoten för kliniska och miljömässiga testning.
Andra in vitro- metoder har utvecklats i ett försök att bättre uppskatta smittsamhet status av norovirus partiklar. Dessa metoder kan vara generellt kategoriseras som de som adress norovirus kapsid integritet och de utvärdera genomet integritet. Det före detta tillvägagångssättet är mer populära. En vanligt förekommande metod är RNase förbehandling före extraktion av viral genomisk RNA, men detta inte tar hänsyn till viruspartiklar som förblir intakta men saknar förmågan att binda värd receptorer/co-faktorer, liksom viruspartiklar som hade dödligt muterade eller har trunkerats eller marginellt skadad genomen7. Kapsid integritet kan också utvärderas baserat på viruset förmåga att binda till mänskliga norovirus co-beta-receptor/co-faktorer, som är kolhydrater kallas histo-blod grupp antigener (HBGAs). HBGAs finns i värd tarmepitelceller som del av glykoproteiner eller glykolipider (bland flera andra vävnader) och kan utsöndras i kroppsvätskor som saliv. Enteriska bakterier som innehåller HBGA-liknande ämnen på sin yta har också visat att binda humana norovirus8,9,10, och sådana interaktioner kan främja norovirus infektion5. Det grundläggande konceptet med att utnyttja HBGA bindning är att endast viruspartiklar kan bindande den förmodade receptorn/co-factor skulle kunna infektera celler. Flera studier tyder på att pärla-baserade HBGA bindande föregår nukleinsyra förstärkning är en lovande metod för smittsamhet diskriminering11,12,13,14, 15,16. En stor utmaning när det gäller HBGAs är att ingen enda HBGA typ kan binda alla humana norovirus genotyper. För att åtgärda detta, har svin gastric mucin, som innehåller HBGAs, använts i stället för renat HBGA kolhydrater intresse användarvänlighet syntes, konsekvens och minskade kostnader.
En ny publikation av Moore et al. 17 införde en rad nya tekniker för att uppskatta mänsklig norovirus kapsid integritet. I stället för HBGAs, Moore et al. 17 undersökt bindningen av en i stort sett reaktiva nukleinsyra aptamer (M6-2)18 och i stort sett reaktiva monoklonal antikropp (NS14)19 att värmebehandlad GII.4 Sydney norovirus förhoppningsvis (virusliknande partiklar eller framställda) och jämfört detta bindningen till syntetiska HBGAs. Nukleinsyra aptamers är kort (~ 20-80 nt) enda stranded nukleinsyror (ssDNA eller RNA) som vika in unika tredimensionella strukturer till följd av deras ordningsföljd och bind ett mål. Eftersom de är nukleinsyror, är de mindre kostsamt; enkelt kemiskt syntetiserade, renat och modifierad; och stabil till värme. Flera rapporter om aptamers genereras mot Norovirus finns, med några av dem visar bred reaktivitet till en mängd olika stammar18,20,21,22. Som exempel kan nämnas Moore et al. 17 visat att aptamer M6-2 bunden till renat, monterade humana norovirus förhoppningsvis (framställda) och betedde sig på liknande sätt att HBGA i beroendet av viral kapsid att bibehålla högre ordning (t.ex. sekundär och tertiär) proteinstruktur för bindning till uppstå. Däremot, en betydande del av norovirus VLP bindning till antikroppar NS14 återstod efter förhoppningsvis var fullständigt denaturerad. Utvärdering av norovirus bindande i studien av Moore et al. 17 var gjort med en enkel, plattan-baserad metod som liknar ELISA, med det undantaget att aptamers används i stället för antikroppar (därav metoden anropades ELASA). Denna hög genomströmning experimentell metod användes för att utvärdera effekterna av olika behandlingar på norovirus kapsid, arbete som är värdefull för att förstå mekanismen av virala agens vid exponering för fysikaliska eller kemiska stressfaktorer. En nackdel med denna metod är dock lägre känslighet och brist på tolerans för matrix-associerade föroreningar på högre nivåer som orsakar icke-specifik bindning av aptamers.
Moore et al. 17 används en annan metod, dynamiskt ljus spridning (DLS), för att övervaka aggregering av viruspartiklar som svar på värmebehandling. DLS används ofta för att bedöma storleken på nanopartiklar suspensioner och har utvidgats till proteiner23,24 och virus25,26,27. Intensiteten hos ljuset som sprids av partiklar i lösningen varierar som en funktion av partikelstorlek, möjliggör beräkning av diffusion koefficient och sedan partikeldiameter med väletablerade formler. DLS tekniken kan skilja spridda partiklar ner till nanoskala, som gör upptäckten av spridda virus, enskilda kapsid proteiner eller dimerer och virus aggregat baserat på storlek27hydrodynamiska diameter. Virus aggregering, företrädd av en ökning av partikelstorlek, är vägledande för förlust av kapsid integritet. Som kapsid är denaturerad och dess struktur störs, hydrofoba rester blir utsatta och orsaka partiklarna att hålla ihop och bilda aggregat. DLS kan användas för att mäta partikelstorlek efter en viss behandling eller kineticsen av aggregation i realtid17,28. Denna metod har fördelen av att observation av kapsid beteende i lösning men kräver höga koncentrationer av renat kapsid, vilket kanske inte är helt representativt av viruset i sitt naturliga tillstånd.
Den sista metoden utnyttjas av Moore et al. 17 var transmissionselektronmikroskopi (TEM). Även om denna metod saknar känslighet och producerar inte kvantitativa data, möjliggör det visualisering av effekterna av olika behandlingar på viral kapsid struktur. Även om inte ännu perfekt för kliniska och miljömässiga inställningar, är användning av dessa metoder i kombination värdefulla för att förstå mänskliga norovirus inaktivering. Syftet med denna artikel är att ge fördjupad protokoll för plattan-baserade bindande analysen (ELASA), DLS, och TEM förberedelse metoder används för att undersöka effekterna av värmebehandlingar på norovirus kapsid i samband med behandlingarna effekter på kapsid integritet som presenteras i Moore et al. 17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well, medium-binding polystyrene EIA plate</td>
			<td>Fisher (Costar)</td>
			<td>07-200-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lid for 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film (Parafilm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (pH 7.2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Individual 0.2 ml PCR tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-154G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 thermocyclers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop mini centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-006-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk solids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0031B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated</td>
			<td>Glycotech</td>
			<td>01-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 &#181;M in nuclease-free water): 5&#39;-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SNN2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8217;,5,5&#8217;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50-76-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M phosphoric acid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader capable of reading 450 nm</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite m200 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis of Plate-Based Assay Results</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel or similar program</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering Experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>02-215-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz cuvette</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>104-002-10-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use)</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>ZEN0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscopy Sample Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel electron microscopy grids with carbon support film</td>
			<td>Ladd Research</td>
			<td>10880-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-closing reverse electron microscopy tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>5372-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Whatman)</td>
			<td>WHA1002055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM stock HEPES solution (pH 7.2)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% uranyl acetate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alternative in vitro methods for the determination of viral capsid structural integrity

Humana norovirus utkräver betydande folkhälsa och ekonomiska förluster i hela världen. Nya in vitro- ännu odling framsteg inte tillämpliga för rutinmässig påvisande av viruset. De nuvarande detektering och kvantifiering teknikerna, som primärt beroende nukleinsyra förstärkning, diskriminerar inte smittsam från icke-infektiösa viruspartiklar. Syftet med denna artikel är att lägga fram specifika detaljer om senaste framstegen inom tekniker som används tillsammans för att erhålla ytterligare information om smittsamhet status av viruspartiklar. En teknik innebär bedömning av bindningen av en norovirus ssDNA aptamer till förhoppningsvis. Aptamers har fördelen av att vara lätt syntetiseras och ändras och är billiga och stabila. En annan teknik, dynamisk ljus spridning (DLS), har fördelen av att observera kapsid beteende i lösning. Elektronmikroskopi möjliggör visualisering av den strukturella integriteten av de virala förhoppningsvis. Även om lovande, finns det några nackdelar att varje teknik, såsom icke-specifik aptamer bindning till positivt laddade molekyler från provmatriser, kravet på renat kapsid för DLS och dålig känslighet för elektronmikroskopi. Ändå, när dessa tekniker används i kombination, ger kroppen produceras mer omfattande information om norovirus kapsid integritet som kan användas för att härleda smittsamhet, information som är nödvändig för korrekt utvärdering av metoder för inaktivering eller tolkning av virus upptäckten. Den här artikeln innehåller protokoll för att använda dessa metoder för att diskriminera infektiösa humana norovirus partiklar.

Den strukturella integriteten av humana norovirus GII.4 Sydney förhoppningsvis (framställda) bedömdes med flera nya metoder som presenteras av Moore et al. 17. först ett experiment utfördes i vilket förhoppningsvis integritet som en funktion av deras förmåga att binda en förmodad receptor/co-factor (HBGA) eller ssDNA aptamer (M6-2) var jämfört (figur 1). Resultaten som visas har tidigare presenterats av Moore et...

Watch this Scientific Journal Video about Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity at JoVE.com

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Rutinmässiga detektionsmetoder utnyttja virusgenom förstärkning är begränsade av sin oförmåga att diskriminera smittsamma från icke-infektiös partiklar. Syftet med denna artikel är att ge detaljerade protokoll för alternativa metoder till stöd i diskriminering av infektiös norovirus partiklar hjälp aptamer bindande, dynamisk ljusspridning och transmissionselektronmikroskopi.

Alternativa In Vitro -metoder för bestämning av Viral kapsid strukturell integritet

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Struktur av HIV-1 kapsid församlingar med Cryo-elektronmikroskopi och Iterativ Helical Real-utrymme återuppbyggnad

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Medelvärdes av Viral höljesglykoproteinet Spikes från Electron Cryotomography rekonstruktioner använder Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Koncentration Fastställande Genom plackanalyser: med hjälp av traditionella och Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Använda Antigen Capsid-inkorporering strategi för utveckling av adenovirus serotyp 5-vektor Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder för att jämföra målbindning och CDC-induktion mellan terapeutiska antikroppar: applikationer i biosimilaritetsanalys

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...