Name: evaluating in vitro dna damage using comet assay
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, NCI e CCR. Tutti gli autori ricevevano assegno di ricerca intramurale da NIH, NCI e CCR.

1. preparare i reagenti <ol><li>1X PBS <ol><li>diluire 100 mL di PBS 10X con 900 mL dH 2 O e regolare il pH a 7,4 utilizzando un pH-metro. Conservare a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Soluzione di lisi (LS) <ol><li>preparare 2,5 M NaCl, EDTA disodico 100 mM, 10 mM Tris base e 200mm NaOH in 900 mL dH 2 O; prende comunemente circa 20 min per consentire la miscela dissolvere completamente. Regolare il pH a 10 utilizzando un pH-metro. Aggiungere 1% sodio l...

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gel/comet+assay:+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing.">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li><li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays.">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li><li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+comet+assay:+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair.">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li><li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy.">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li><li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+targeted+therapy:+The+past+or+future+of+cancer+treatment?.">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?.</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li><li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy.">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157 (2015).</li><li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li><li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+Repair+in+Cancer:+Beyond+PARP+Inhibitors.">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair.">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li><li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay.">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay.">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200 (2014).</li></ol>

Il test della cometa è uno strumento efficace per misurare le rotture di singolo e doppio filamento del DNA a livello cellulare. Il dosaggio è stato ampiamente applicato come un "golden standard" negli studi per quanto riguarda la genotossicità e biomonitoraggio13, che vanno dalle lesioni della base, legami incrociati del DNA, lo sviluppo di farmaci e siti sensibili dell'alcali. Nello studio presente, abbiamo mostrato due distinti protocolli passo-passo per i dosaggi cometa alcalino e neutro, r...

Il test della cometa è stato sviluppato da Ostling e Johanson nel 1984 dimostrando che la migrazione del DNA frammenti dai nuclei in un neutro condizione1. La tecnica venne successivamente sviluppata da Singh et al., mostrando che una condizione alcalina notevolmente aumentata la specificità e la riproducibilità del test2. Da allora, l'analisi della cometa neutro principalmente è usato per rilevare le rotture del doppio filamento del DNA, mentre l'analisi alcalina della cometa è più sensibile per piccoli importi di danno del DNA, compreso il singolo e doppio filamento del DNA si rompe, siti alcali-labili, DNA-DNA o Cross-linking del DNA-proteina e rotture del singolo filamento del DNA connesse con l'asportazione incompleta ripristino siti3,4. Entrambe le analisi permettono la visualizzazione di DNA frammentato e forniscono un modo semplice per valutare quantitativamente il danno del DNA. Il test della cometa è considerato come un metodo sensibile per gli studi tossicologici genetici in vitro e in vivo ed è applicabile ad aree di ricerca diversi, quali la selezione precoce di droga-candidato, monitoraggio ambientale, biomonitoraggio umano, e fondamentale ricercare in danno del DNA e riparazione5.
Il principio del test è che, in un campo elettrico, DNA frammentato migra fuori dal corpo di nucleoide (conosciuto anche come la "testa della cometa") e forma una macchia di DNA in gel di agarosio (noto anche come "coda di cometa"). Con la colorazione del nucleotide nella misura di danno del DNA può essere quantificata analizzando "comete" formate da questo elettroforesi unicellulare. Calcolo del momento di coda può aiutare ulteriormente a confrontare il danno del DNA fra differenti gruppi sperimentali. Rispetto ai tradizionali metodi di rilevamento dei danni del DNA, il test della cometa è diretto, sensibile, poco costoso e relativamente semplice.
La radioterapia e la chemioterapia è strategie comuni per il trattamento del cancro generando filo singolo e doppio filamento DNA si rompe in cromosomi6. Il recente progresso nella inibitori di riparazione del DNA permette un più efficace effetto genotossico di chemioterapia di combinazione e quindi, potenzialmente riduce effetti collaterali sistemici quali l'anemia, infezioni e midollo osseo soppressione7, 8. in questo studio, abbiamo dimostrato l'inchiesta di un inibitore di poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP), olaparib (Ola)9. PARP è una proteina nucleare abbondante ed è responsabile della riparazione bassa di asportazione del DNA formando un polimero di poli (ADP-ribosio)10. Temozolomide (TMZ) è un agente alchilante orale disponibile ed è stato ampiamente usato per il trattamento di pazienti di glioma. Utilizzando l'analisi della cometa per quantificare il danno del DNA, dimostriamo che combinando olaparib con temozolomide profondamente migliora il danno del DNA in cellule del glioma, che suggerisce la terapia di combinazione di olaparib/temozolomide è una strategia efficace per il trattamento di gliomi, confrontato con temozolomide solo11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">10x PBS(Ca++, Mg++ free)</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">E0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium lauryl sarcosinate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L7414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Low melting point agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:101px;">WARNER-GRAHAM</td>
			<td style="width:119px;">#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:101px;">GIBICO</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glass tissue slides</td>
			<td style="width:101px;">ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td style="width:119px;">63422-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:101px;">KIMberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:101px;">DENVILLE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:101px;">SHARP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipments</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:101px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Waterbath</td>
			<td style="width:101px;">PRECISION</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horizontal electrophoresis chamber</td>
			<td style="width:101px;">TREVIGEN</td>
			<td style="width:119px;">Cometassay ES II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power supply</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:101px;">Quincy Lab</td>
			<td style="width:119px;">Model 12-140E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micropipettor</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating in vitro dna damage using comet assay

Danno del DNA è un fenomeno comune per ogni cella durante la sua esistenza ed è definito come un'alterazione della struttura chimica del DNA genomico. Terapie del cancro, come la radio e la chemioterapia, introducono una quantità enorme di ulteriori danni al DNA, che conduce all'arresto del ciclo cellulare e apoptosi per limitare la progressione del cancro. Valutazione quantitativa del danno del DNA durante la terapia sperimentale del cancro è un passo fondamentale per giustificare l'efficacia di un agente genotossico. In questo studio, ci concentriamo su un'analisi di elettroforesi unicellulare, noto anche come il test della cometa, che si può quantificare singolo e doppio filamento DNA si rompe in vitro. Il test della cometa è un metodo di quantificazione del danno del DNA che è efficiente e facile da eseguire, e ha basse esigenze di budget di tempo e un'elevata riproducibilità. Qui, si evidenzia l'utilità di analisi della cometa per uno studio preclinico valutando l'effetto genotossico olaparib/temozolomide della terapia di combinazione di cellule di glioma U251.

Il presente protocollo viene descritto un flusso di lavoro dettagliato per l'esecuzione di analisi di cometa e analisi dei dati (Figura 1). Risultati dall'analisi della cometa alcalino e neutro ha mostrato che la coda della cometa di cellule di U251 trattati con doxorubicina (1 µM, 20 h) era più lungo e aveva una maggiore intensità di DNA, suggerendo un notevole accumulo di DNA frammentato a causa della chemioterapia (Figura 2...

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Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l'effetto terapeutico della chemioterapia.

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

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