Name: evaluating in vitro dna damage using comet assay
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay at JoVE.com

Это исследование было поддержано интрамуральных исследовательской программы NIH, NCI и CCR. Все авторы получили интрамуральных исследовательский грант от НИЗ, NCI и CCR.

1. Подготовка реагентов <ol><li><ol><li>ПБС разбавляют 100 мл 10 x PBS с 900 мл dH 2 O и скорректировать рН 7,4, с помощью рН метр. Хранить при комнатной температуре.</li>
	</ol></li> <li>Лизис раствор (LS) <ol><li>подготовить 2,5 М NaCl, ЭДТА динатрия 100 мм, 10 мм Tris база и 200 мм NaOH в 900 мл dH 2 O; это о?...

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gel/comet+assay:+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing.">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li><li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays.">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li><li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+comet+assay:+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair.">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li><li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy.">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li><li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+targeted+therapy:+The+past+or+future+of+cancer+treatment?.">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?.</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li><li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy.">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157 (2015).</li><li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li><li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+Repair+in+Cancer:+Beyond+PARP+Inhibitors.">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair.">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li><li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay.">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay.">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200 (2014).</li></ol>

Assay комета является эффективным инструментом для измерения одно и двухнитевые разрывы ДНК на клеточном уровне. Assay широко применяется как «золотой стандарт» в исследованиях о генотоксичности и биомониторинга13, начиная от базового поражений, сшивки ДНК, разработки лекарст...

Assay комета была впервые разработана Остлинг и Йохансон в 1984 году, продемонстрировав, что миграция ДНК фрагменты из ядер под нейтральной условие1. Техника позднее был разработан Singh et al., показаны, что щелочной значительно увеличила специфичность и воспроизводимость пробирного2. С тех пор, пробирного нейтральных кометы в основном используется для обнаружения двуцепочечные разрывы ДНК, в то время как assay щелочной комета является более чувствительным для небольших сумм повреждения ДНК, включая одноместные и двойной нити ДНК влезает, щелочно лабильного сайтов, ДНК-ДНК или ДНК белковых сшивки и разрывы сингл нить ДНК, связанные с неполной иссечение ремонт сайтов3,4. Оба анализы позволяют визуализации фрагментированных ДНК и предоставляют простой способ количественно оценить повреждение ДНК. Комета рассматривается как чувствительный метод для в пробирке и в vivo генетических токсикологических исследований и применим для различных научно-исследовательских областях, таких как раннего отбора наркотиков кандидат, мониторинг окружающей среды, человеческого биомониторинга, и фундаментальные исследования в повреждения ДНК и ремонт5.
Принцип анализа, что под электрического поля, раздробленной ДНК мигрирует из nucleoid тела (также известный как «голова кометы») и формирует пятно ДНК в агарозном геле (также известный как «хвост кометы»). С нуклеотидом окрашивание, степень повреждения ДНК может быть определена количественно, анализируя «кометы» сформировал электрофорезом этой одной ячейки. Далее расчет момента хвост может помочь сравнить повреждение ДНК среди различных экспериментальных групп. По сравнению с традиционными методами обнаружения повреждения ДНК, комета assay прямой, чувствительных, недорогой и относительно простой.
Лучевой терапии и химиотерапии являются общие стратегии для лечения рака, создавая одинарная и двойная нить ДНК перерывы в хромосом6. Недавние улучшения в ремонт Ингибиторы ДНК позволяет более эффективным генотоксичных эффект химиотерапии и поэтому потенциально сокращает системные побочные эффекты, такие как анемия, инфекции и костного подавления7, 8. в этом исследовании, мы показали расследования ингибитор поли (АДФ рибоза) полимеразы (ПАРП), olaparib (УПВ)9. ППА является обильным ядерных белков и отвечает за базовые иссечение репарации ДНК путем формирования поли (АДФ рибоза) полимер10. Темозоламид (ТМЗ) является алкилирующим агентом, устно доступных и широко используется для лечения пациентов глиомы. Используя комета assay для количественного определения повреждения ДНК, мы демонстрируем, что сочетание olaparib с Темозоламид глубоко повышает повреждение ДНК клеток глиомы, который предполагает, что olaparib/Темозоламид комбинированной терапии является эффективной стратегией для лечения глиомы, по сравнению с Темозоламид только11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">10x PBS(Ca++, Mg++ free)</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">E0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium lauryl sarcosinate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L7414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Low melting point agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:101px;">WARNER-GRAHAM</td>
			<td style="width:119px;">#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:101px;">GIBICO</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glass tissue slides</td>
			<td style="width:101px;">ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td style="width:119px;">63422-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:101px;">KIMberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:101px;">DENVILLE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:101px;">SHARP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipments</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:101px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Waterbath</td>
			<td style="width:101px;">PRECISION</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horizontal electrophoresis chamber</td>
			<td style="width:101px;">TREVIGEN</td>
			<td style="width:119px;">Cometassay ES II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power supply</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:101px;">Quincy Lab</td>
			<td style="width:119px;">Model 12-140E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micropipettor</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating in vitro dna damage using comet assay

Повреждение ДНК является обычным явлением для каждой ячейки во время его жизни и определяется как изменение химического состава геномной ДНК. Лечения рака, такие как радио - и химиотерапии, ввести огромное количество дополнительных повреждений ДНК, ведущих к арест клеточного цикла и апоптоз ограничить прогрессии рака. Количественная оценка повреждения ДНК в ходе экспериментальной рака терапии является ключевым шагом для обоснования эффективности генотоксичных агента. В этом исследовании мы ориентируемся на одну ячейку электрофорез assay, также известный как assay кометы, которые могут количественно охарактеризовать одной и ДНК двухнитевые разрывы в пробирке. Assay комета является метод количественной оценки повреждения ДНК, который является эффективным и легко выполнять, и имеет низкий бюджет времени требованиями и высокую воспроизводимость. Здесь мы подчеркнуть полезность комета assay доклинические исследования, оценивая эффект генотоксичных olaparib/Темозоламид комбинированной терапии для U251 клеток глиомы.

Настоящий Протокол описывает шаг за шагом рабочего процесса для комета пробирного исполнения и анализа данных (рис. 1). Результаты анализов щелочных и нейтральных кометы показали, что хвост кометы доксорубицин лечение U251 клеток (1 мкм, 20 h) был длиннее и б...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay at JoVE.com

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Оценки в Vitro повреждения ДНК, используя Assay комета

Assay комета является эффективным методом для обнаружения повреждения ДНК, включая одиночные и двуцепочечной ДНК разрывами страниц. Мы описываем щелочных и нейтральных комета анализов для определения повреждения ДНК в раковых клетках оценить терапевтический эффект химиотерапии.

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Режиме реального времени обнаружения в апоптоз клеток in Vitro опухоли индуцированные CD8 клетки+ T для изучения подавляющей иммунные функции проникновения опухоли миелоидных клеток

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

В vitro Анализ для изучения опухоли макрофаг взаимодействия

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Оценка дифференциации потенциала мыши простаты эпителиальных клеток с использованием органоидной культуры

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Иммунофлуоресценция Визуализация повреждения ДНК и ремонт Фочи в раковых клетках толстой кишки человека

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Трехмерная биомиметическая модель нейробластомы in vitro с использованием скаффолдов на основе коллагена

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...