Name: evaluating in vitro dna damage using comet assay
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00
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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramuros de los NIH, el NCI y el CCR. Todos los autores recibieron beca de investigación intramuros de NIH, NCI y CCR.

1. preparar reactivos <ol><li>1 x PBS <ol><li>diluir 100 mL 10 x PBS con 900 mL dH 2 O y ajustar el pH a 7.4 con un medidor de pH. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Solución de lisis (LS) <ol><li>preparar 2.5 M NaCl, 100 mM disódico EDTA, 10 mM Tris base y 200 mM NaOH en 900 mL dH 2 O; comúnmente tarda unos 20 minutos para permitir que la mezcla se disuelva completamente. Ajustar el pH a 10 con un medidor de pH. Agregar 1% Sodio Lauril sar...

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gel/comet+assay:+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing.">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li><li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays.">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li><li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+comet+assay:+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair.">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li><li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy.">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li><li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+targeted+therapy:+The+past+or+future+of+cancer+treatment?.">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?.</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li><li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy.">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157 (2015).</li><li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li><li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+Repair+in+Cancer:+Beyond+PARP+Inhibitors.">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair.">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li><li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay.">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay.">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200 (2014).</li></ol>

El ensayo cometa es una herramienta eficaz para medir solo y doble cadena roturas del ADN a nivel celular. El ensayo se ha aplicado extensamente como un "estándar de oro" en los estudios sobre genotoxicidad y biomonitoreo13, que van desde lesiones de base ADN reticulaciones, desarrollo de fármacos y sitios sensibles de álcali. En el presente estudio, hemos mostrado dos protocolos distintos paso a paso para los ensayos de comet alcalino y neutro, respectivamente. Combinación de electroforesis u...

El análisis del cometa primero fue desarrollado por Ostling y Johanson en 1984 demostrando que la migración del ADN de fragmentos de los núcleos en un estado neutro1. La técnica fue desarrollada más tarde por Singh et al., mostrando que una condición alcalina aumenta sustancialmente la especificidad y la reproducibilidad del ensayo2. Desde entonces, el análisis del cometa neutro se utiliza sobre todo para detectar roturas de la DNA de doble cadena, mientras que el ensayo del cometa alcalino es más sensible para cantidades más pequeñas de daño en el ADN, incluyendo solo y doble cadena de ADN rompe, sitios álcali lábil, DNA-DNA o Cross-linking de la proteína ADN y rupturas monocatenarias de DNA asociadas con la supresión incompleta de reparación sitios3,4. Ambos ensayos permiten visualización de ADN fragmentado y proporcionan una manera sencilla de evaluar cuantitativamente el daño de la DNA. El análisis del cometa es considerado como un método sensible para estudios toxicológicos genéticos in vitro e in vivo y es aplicable a las áreas de investigación, tales como la selección precoz candidato a fármaco, monitoreo ambiental, control biológico humano, y fundamental de investigación en daño de la DNA y reparación5.
El principio del ensayo es que bajo un campo eléctrico, el DNA fragmentado migra fuera del cuerpo de nucleoid (también conocido como la "cabeza de cometa") y forma una mancha de ADN en el gel de agarosa (también conocido como la "cola de cometa"). Con nucleótidos la coloración, el grado de daño del ADN puede cuantificarse mediante el análisis de "cometas" formados por esta electroforesis unicelular. Cálculo del momento de cola más puede ayudar a comparar los daños en el ADN entre los diferentes grupos experimentales. En comparación con los métodos tradicionales de detección de daño de ADN, el análisis del cometa es directa, sensible, barato y relativamente sencillo.
Radioterapia y quimioterapias son estrategias comunes para el tratamiento del cáncer mediante la generación de hebra y ADN de doble cadena se rompe en los cromosomas6. El avance reciente de inhibidores de la reparación de ADN permite un más eficaz efecto genotóxico por quimioterapia de combinación y por lo tanto, reduce los efectos secundarios sistémicos tales como anemia, infección y la médula ósea supresión7, 8. en este estudio, mostramos la investigación de un inhibidor de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), olaparib (Ola)9. PARP es una proteína nuclear abundante y es responsable de la reparación de la base de la supresión de ADN mediante la formación de un polímero de poli (ADP-ribosa)10. La temozolomida (TMZ) es un agente alquilante oral disponible y ha sido ampliamente utilizado para el tratamiento de pacientes de glioma. Utilizando el ensayo cometa para cuantificar daños en el ADN, demostramos que combina olaparib con temozolomida profundamente mejora el daño de la DNA en células de glioma, que sugiere terapia combinada olaparib/temozolomida es una estrategia eficaz para tratar el glioma, en comparación con temozolomida sólo11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">10x PBS(Ca++, Mg++ free)</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">P0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:101px;">TEKnova</td>
			<td style="width:119px;">E0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium lauryl sarcosinate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L7414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium acetate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Low melting point agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:101px;">WARNER-GRAHAM</td>
			<td style="width:119px;">#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:101px;">GIBICO</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glass tissue slides</td>
			<td style="width:101px;">ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td>
			<td style="width:119px;">63422-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:101px;">KIMberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:101px;">DENVILLE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:101px;">SHARP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipments</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microwave</td>
			<td style="width:101px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Waterbath</td>
			<td style="width:101px;">PRECISION</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horizontal electrophoresis chamber</td>
			<td style="width:101px;">TREVIGEN</td>
			<td style="width:119px;">Cometassay ES II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power supply</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:101px;">Quincy Lab</td>
			<td style="width:119px;">Model 12-140E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micropipettor</td>
			<td style="width:101px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating in vitro dna damage using comet assay

Daños en el ADN es un fenómeno común para cada celda durante su vida útil y se definición como una alteración de la estructura química de la DNA genomic. Tratamientos contra el cáncer, tales como radio y quimioterapia, introduce gran cantidad de daño de ADN adicional, llevando a la detención del ciclo celular y apoptosis para limitar la progresión del cáncer. Evaluación cuantitativa del daño de la DNA durante la terapia experimental del cáncer es un paso clave para justificar la eficacia de un agente genotóxico. En este estudio, nos centramos en un análisis de electroforesis unicelular, también conocido como el ensayo del cometa, que puede cuantificar solo y doble cadena ADN rompe en vitro. El ensayo cometa es un método de cuantificación de daños de ADN que es eficiente y fácil de realizar, y tiene demandas de tiempo y dentro de presupuesto bajo y alta reproducibilidad. Aquí, destacamos la utilidad del ensayo cometa para un estudio preclínico por evaluar el efecto genotóxico de la terapia de combinación de olaparib/temozolomida a las células de glioma U251.

El presente Protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la ejecución del ensayo de cometa y análisis de datos (figura 1). Resultados de los ensayos de comet alcalino y neutro mostraron que la cola del cometa de doxorrubicina-U251 las células tratadas (1 μm, 20 h) era más largo y tenía mayor intensidad de ADN, lo que sugiere una sustancial acumulación de ADN fragmentado debido a la quimioterapia (figura 2).
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Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

El ensayo cometa es un método eficiente para detectar daños en el ADN como sola y doble hebra de ADN se rompe. Se describen ensayos cometa alcalino y neutral para medir el daño del ADN en células de cáncer para evaluar el efecto terapéutico de la quimioterapia.

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