Name: using the dot assay to analyze migration of cell sheets
Uploaded: 2017-12-05T13:00:00
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L’auteur tient à remercier zemzmi Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo et Carole Parent pour lire et commenter sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Cancer Institute, National Institutes of Health.

1. revêtement de plats (jour 1)
Remarque : Veillez à ne pas laisser des empreintes digitales ou la saleté sur le bas de la plaque lors de la manipulation il.
<ol><li>Décongeler le collagène IV sur la glace de la souris et le diluer avec HCl (pH 1.3) 50 mM pour préparer 3 mL d’une solution de IV 10 µg/mL collagène. NOTE : Collagène précipitera à 37 ° C. Il est donc important de garder la solution du collagène à basse température en fonte et en travaillant avec elle. Éviter les cycles de gel...

<ol>
	<li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. 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A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+over+long+time+scales+reveals+distinct+phenotypes.">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).</li><li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration.">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. 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Les cellules tumorales progression migrent vers loin le tissu d’origine à envahir les tissus environnants et à métastaser dans des endroits éloignés,15. Migration des cellules d’une colonie de cellules peut être observée dans l’essai de la dot. Ici, le dosage de la dot est illustré en analysant le phénotype migratoire des cellules cancéreuses du sein humain en réponse à l’EGF.
Pour obtenir des résultats exacts et reproductibles plusieurs étapes dan...

Les essais de migration sont largement utilisés pour évaluer le potentiel invasif et métastatique des cellules tumorales in vitro. Le plus souvent, la blessure ou le zéro dosage sert à évaluer les migration des feuilles épithéliales dans une cellule effacée zone1,2,3. Pour effectuer le test de gratter, les cellules sont plaqués en une monocouche et un « scratch » ou zone acellulaire est créé avec un embout de la pipette. Le test de scratch est facile à configurer avec fournitures de vitroplants couramment disponible et peut être effectué en plaques multipuits, permettant ainsi à la transformation de plusieurs échantillons. Cependant, comme le scratch est fait, les cellules sont physiquement supprimées de la monocouche et souvent subir une mort cellulaire. En outre, fixée à la plaque de la matrice extracellulaire est souvent endommagée pendant le processus de se gratter. De même, l’utilisation de silicium insère (comme Ibidi chambres4) ou des pochoirs5,6,7 peut conduire à une rupture mécanique des cellules et l’élimination partielle des protéines de la matrice utilisée pour le revêtement de la plaques. Un autre inconvénient des essais de contrôle de fermeture des plaies ou égratignures est leur cours de durée limitée, comme la migration cellulaire seulement peut être analysée jusqu'à la fermeture de l’éraflure.
Dans la réalisation de l’essai de la dot, les cellules sont plaqués comme une colonie circulaire sur une plaque revêtues ou non revêtues8. La justification de cette stratégie de placage est d’obtenir des feuilles de cellule avec bords définis, qui peuvent migrer ou envahir dans les environs d’acellulaire sans perturber la culture par prélèvement de cellules ou d’inserts. L’objectif global de l’essai de la dot est d’observer la migration des feuilles de cellule, telle que mesurée par le déplacement de bord ou le diamètre des colonies, ainsi qu’effectuer une imagerie Time-lapse pour analyser le phénotype migratoire des cellules en plus haute résolution spatio-temporelle.
La migration cellulaire peut être affectée par une variété de signaux micro-environnementales comme facteurs de croissance tels que l’EGF, cytokines et chimiokines. EGF est un facteur de croissance qui exerce ses effets biologiques via la liaison à son récepteur, le récepteur EGF9et augmente le comportement envahissant et métastatique des tumeurs des cellules4,9,10. Ici, le test de point est utilisé pour étudier EGF stimulée la migration cellulaire dans une colonie de poumon humain envahissantes, formant breast cancer cell line (MCF10CA1a)8,11,12.

<table style="border-collapse:collapse;width:659pt" width="878">
	<colgroup>
		<col style="width:302pt" width="402" />
		<col style="width:160pt" width="213" />
		<col style="width:131pt" width="175" />
		<col style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="width:302pt;height:15.75pt" width="402">MCF10CA1a cells</td>
			<td style="width:160pt" width="213">Karmanos Research Institute</td>
			<td class="xl18" style="width:131pt" width="175">N/A</td>
			<td style="width:66pt" width="88">cells used for asay</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">mouse collagen IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td class="xl18">354233</td>
			<td>used to coat plates</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">trypsin / EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">25300054</td>
			<td>used to remove cells from tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">DPBS&#160;</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td class="xl18">21-031-CV</td>
			<td>used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">DMEM / F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl18">11320082</td>
			<td>used as culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl18">26050088</td>
			<td>used to supplement culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">12well glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td class="xl18">P12G-1.5-14-F</td>
			<td>used to grow cells for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid )</td>
			<td>Cayman</td>
			<td class="xl18">10093</td>
			<td>used to stimulate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">EGF (epidermal growth factor, human recombinant)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td class="xl18">AF-100-15</td>
			<td>used to stimulate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td class="xl18">A8806-1G</td>
			<td>used to make buffer for LPA and EGF</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td class="xl18">HHS32</td>
			<td>used to stain colonies</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">eosin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td class="xl18">26051-10</td>
			<td>used to stain colonies</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">37C, 5% CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td class="xl18">model MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td class="xl18">model Axio Observer.Z1</td>
			<td>used for time lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">ORCA Flash LT sCMOS camera</td>
			<td>BioVision</td>
			<td class="xl21">C11440-42U-KIT</td>
			<td>used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Metamorph</td>
			<td>BioVision</td>
			<td class="xl18">MMACQMIC</td>
			<td>software used for time lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td class="xl18">model IX70</td>
			<td>used to count cells and to check colonies in tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">plastic box</td>
			<td>Lock&#38;Lock</td>
			<td class="xl18">N/A</td>
			<td>used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the dot assay to analyze migration of cell sheets

Bien que des organismes complexes apparaissent statiques, leurs tissus subissent une rotation continue. Comme les cellules âge, meurent et sont remplacées par de nouvelles cellules, cellules se déplacent dans les tissus d’une manière bien orchestrée. Au cours du développement de la tumeur, cet équilibre est perturbé, et les cellules tumorales quittent l’épithélium d’origine pour envahir le microenvironnement local, se rendre dans des endroits éloignés et pour finalement former des tumeurs métastatiques dans des sites éloignés. L’essai de la dot est un test simple, deux dimensions de la migration sans contrainte, pour évaluer le mouvement net de feuilles de cellule dans une zone acellulaire et d’analyser les paramètres de la migration cellulaire à l’aide de l’imagerie Time-lapse. Ici, le dosage de la dot est démontré à l’aide un homme envahissante, la colonie de poumon formant la lignée de cellules de cancer du sein, MCF10CA1a, pour analyser la réponse migratoire LiPo au facteur de croissance épidermique (EGF), qui est connu pour augmenter le potentiel maligne de cellules cancéreuses du sein et pour modifier le phénotype migratoire des cellules.

L’essai de point présenté ici (Figure 1) a été réalisée par envahissantes, formant des cellules de cancer du sein (MCF10CA1a) comme système modèle des colonies de poumon. Le dosage de la dot donne des points de cellules hautement reproductible même dans la main de débutants, ce qui en fait un moyen pratique et facile à exécuter le test (Figure 1D). Le test point combiné avec il coloration ou Time-l...

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Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Utilisant le test de Dot pour analyser la Migration des cellules feuilles

La migration cellulaire est essentielle pour le développement, la maintenance du tissue et réparation et tumorigenèse et est régulée par des facteurs de croissance, cytokines et chimiokines. Ce protocole décrit le dosage de la dot, une analyse bidimensionnelle, sans contrainte de migration afin d’évaluer le phénotype migrateur de feuilles de cellule cohésive, attaché en réaction aux signaux micro-environnementales.

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

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Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...

Quantifying Telomere Length Using Non-Radioactive Chemiluminescence Detection

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Optimisation des paramètres de performance du test de longueur des télomères TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

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Enhancing Targeted Cancer Diagnosis by Quantifying Single-Cell Mechanics

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Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...