Name: a simple approach to induce experimental autoimmune neuritis in c57bl/6 mice for functional and neuropathological assessments
Uploaded: 2017-11-09T13:00:00
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DGG est NHMRC Peter Doherty et Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA) début carrière Fellow. JLF est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale MSRA. Ce travail a été soutenu par l’Australian National Health et projet Medical Research Council (NHMRC) accorder #APP1058647 à JX.

toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’Institut Florey pour les neurosciences et le Comité d’éthique de la santé mentale (Centre de cerveau de Melbourne) Animal et suivre le Code de pratique australienne pour l’utilisation des animaux pour scientifique Application.
 1. Induction EAN Remarque : EAN peut être induite avec succès chez les souris C57BL/6 mâles âgés de 6 à 8 semaines. Le protocole d’induction dure 9 jours au to...

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	<li>Newswanger, D. L., Warren, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barre+syndrome.">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).</li><li>Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+Guillain-Barre+syndrome+mortality+in+Spain+from+1999+to+2013.">Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013.</a> Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).</li><li>Walling, A. D., Dickson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barre+syndrome.">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).</li><li>Gonsalvez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+and+Neuropathological+Testing+Paradigm+Reveals+New+Disability-Based+Parameters+and+Histological+Features+for+P0180-199-Induced+Experimental+Autoimmune+Neuritis+in+C57BL/6+Mice.">A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).</li><li>Berg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barre+syndrome:+pathogenesis,+diagnosis,+treatment+and+prognosis.">Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis.</a> Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).</li><li>Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy--update+on+pathogenesis,+diagnostic+criteria+and+therapy.">Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy.</a> Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).</li><li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+the+motor-sensory+axonal+Guillain-Barre+syndrome.">Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome.</a> Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).</li><li>Taylor, W. A., Hughes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+neuritis+induced+in+SJL+mice+by+bovine+P2.">Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2.</a> J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).</li><li>Zou, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P0+protein+peptide+180-199+together+with+pertussis+toxin+induces+experimental+autoimmune+neuritis+in+resistant+C57BL/6+mice.">P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice.</a> J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).</li><li>Miletic, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P0(106-125)+is+a+neuritogenic+epitope+of+the+peripheral+myelin+protein+P0+and+induces+autoimmune+neuritis+in+C57BL/6+mice.">P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).</li><li>Hafer-Macko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+motor+axonal+neuropathy:+an+antibody-mediated+attack+on+axolemma.">Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma.</a> Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).</li><li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+nodal+changes+in+the+acute+motor+axonal+neuropathy+pattern+of+the+Guillain-Barre+syndrome.">Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome.</a> J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).</li></ol>

Le présent rapport décrit une méthode simple pour provoquer l’EAN utilisant le peptide de180-199 P0 chez les souris C57BL/6, qui permet la quantification des principaux déficits neuropathologiques et fonctionnelles chez la souris induits avec EAN. Distincte pour le protocole d’induction EAN décrit ici est l’utilisation de l’anesthésie, tout en effectuant les injections de vaccination. L’utilisation de l’anesthésie isoflurane améliore grandement la capacité de faire en sorte que le volume t...

Les neuropathies périphériques peuvent être origine génétique ou acquise, avec neuropathies acquises ayant soit métabolique, ischémique, précipitants inflammatoires ou toxiques. Ces maladies sont également utilement classées comme axonale ou demyelinative à l’origine. Le plus souvent acquis démyélinisantes les neuropathies périphériques sont la polyneuropathie démyélinisante inflammatoire aiguë (paid, aussi connu comme le syndrome de Guillain-Barré, GBS) et Polyneuropathie inflammatoire chronique démyélinisante (CIDP)1, 2 , 3 , 4; les deux sont pathogenetically caractérisées par une réaction auto-immune dirigée contre la gaine de myéline, causant la démyélinisation des nerfs périphériques. Dans ces maladies, les lymphocytes T activés traversent la barrière de nerf de sang et de génèrent une réaction immunitaire dans le PNS. Activation des macrophages dans le nerf puis provoque la démyélinisation soit directement via attaque phagocytaire, soit indirectement par l’intermédiaire de médiateurs de l’inflammation sécrétées, entraînant des troubles cliniques tels que paralysie et dysfonctionnement sensoriel5. Tandis que les axones démyélinisés conservent la capacité d’être remyelinated après la démyélinisation, remyélinisation est souvent retardée ou incomplète, entraînant la susceptibilité des axones nus à des dommages irréversibles, qui est la cause principale de la clinique permanent personnes handicapées. Actuellement, les traitements les plus efficaces sont des immunomodulateurs, mais malgré leur efficacité, dans de nombreux cas la récupération est souvent lente et environ 25 % des patients éprouveront des déficits fonctionnels résiduels qui réduisent considérablement leur qualité de vie de6, 7.
EAN est un modèle animal couramment des maladies démyélinisantes neuropathie périphérique qui a fourni des renseignements précieux sur pathogenèse et un moyen d’évaluer de nouveaux agents thérapeutiques4. Ce modèle peut être induit chez les différentes espèces comme les lapins, rats, souris et les cochons d’Inde et est induite par l’immunisation avec des antigènes neurogènes. Toutefois, en fin de compte l’induction EAN réussie repose sur une réponse immunitaire appropriée pour la maladie de se produire. Compte tenu des variations de l’espèce (et inter-espèce/souche) la fonction immunitaire, plusieurs combinaisons d’antigènes et adjuvants ont été développés pour provoquer avec succès l’EAN. En ce qui concerne les outils de génétiques murines, le C57BL/6 est la plus largement utilisée ; Toutefois, le peptide de protéine P2 traditionnel 57-81 (P257-81) qui se traduit par la maladie dans la souche de souris sensibles SJL8 est incapable de pathogenèse illicite conduisant à des déficits fonctionnels chez la souche C57BL/6. Heureusement, les paradigmes de sensibilisation utilisant le P0106-125 ou P0180-199 peptides, livré en adjuvant combiné avec l’injection de la coqueluche, la toxine peut surmonter cet obstacle, permettant aux outils sophistiqués de génétiques être utilisés dans le modèle murin de EAN.
Ici, on présente une méthode simple pour l’induction de l’EAN chez les souris C57BL/6. En outre, une approche globale et détaillée permettant d’évaluer les déficits fonctionnels et neuropathologiques associés à la maladie est fournie. Le P0180–199 peptide9 a été choisie plutôt que le remplacement de P057-81 10. Le modèle de199 P0180–a été décrit pour produire des signes cliniques moins sévères par rapport à l' alternative de P057-81 10et est donc susceptible de résister à l’introduction de potentiellement des perturbations génétiques délétères, récupérer des interventions chirurgicales (par exemple, implantation de pompe osmotique) et se prête à la fonction de marche tapis roulant stable4. Cependant, le tapis roulant démarche tests de la fonction et histologiques protocoles décrits ici pourraient facilement être appliquées lors de l’étude de la maladie dans une variante de57-81 induite par P0.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6, male, 6-8 weeks old</td>
			<td>Australian Bioresources Cenre, WA, Australia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc., CA, USA</td>
			<td>#181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Laboratories will have their own protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pharmachem, QLD, Australia</td>
			<td></td>
			<td>Laboratories will have their own protocol for administration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P0180&#8211;199 peptide</td>
			<td>Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN</td>
			<td></td>
			<td>P0180&#8211;199, sequence S&#8211;S&#8211;K&#8211;R&#8211;G&#8211;R&#8211; Q&#8211;T&#8211;P&#8211;V&#8211;L&#8211;Y&#8211;A&#8211;M&#8211;L&#8211;D&#8211;H&#8211;S&#8211;R&#8211;S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)</td>
			<td>Difco, MI, USA</td>
			<td>#231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s complete adjuvant (FCA)</td>
			<td>Difco, MI, USA</td>
			<td>#263910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>#15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA day of tissue collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldheyde</td>
			<td>ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia</td>
			<td>#11-30-8</td>
			<td>Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td>
			<td>SL189</td>
			<td>Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td>
			<td>SA030</td>
			<td>Use at 30% (w/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) medium</td>
			<td>Sakura Finetek, CA, USA</td>
			<td>#4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore, MA, USA</td>
			<td>#S30-100</td>
			<td>Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma Aldrich, MI, USA</td>
			<td>#90o2-31-1</td>
			<td>Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies), CA, USA</td>
			<td>S12700</td>
			<td>Used at 1:400 or titrate in own lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)</td>
			<td>Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel</td>
			<td></td>
			<td>Used at 1:500 or titrate in own lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA</td>
			<td>Various</td>
			<td>Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting solution</td>
			<td>Dako (Agilent), CA, USA</td>
			<td>#S3023</td>
			<td>Each laboratory will have their own preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL syringe with 301/2 g needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>#326105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 g needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>#305143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red ink pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals&#39; feet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGate apparatus (includes treadmill)</td>
			<td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGate Imaging System</td>
			<td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any timer may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGait 8 Software</td>
			<td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate dissecting microscope may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged slides</td>
			<td>Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd</td>
			<td>SF41296SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyrostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Any suitable cyrostat may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equipment and dissecting instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Labs will have their own perfusion protoctols.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque humified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Labs may produce their own using an opaque plastic container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pene</td>
			<td>GeneTex (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeis LSM780</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI/Image J</td>
			<td>National Institues of Health</td>
			<td></td>
			<td>Available from www.fiji.sc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple approach to induce experimental autoimmune neuritis in c57bl/6 mice for functional and neuropathological assessments

Névrite auto-immune expérimentale (EAN) est un modèle expérimental fort apprécié des maladies démyélinisantes périphériques auto-immunes. Maladie de l’EAN est induite par l’immunisation de souris avec des peptides neurogènes pour diriger une attaque inflammatoire vers les composants du système nerveux périphérique (PNS). Les progrès récents ont permis à l’induction de l’EAN dans la lignée de souris C57BL/6 relativement résistante à l’aide de la protéine zéro (P0)106-125 ou P0180-199 peptides livrés en adjuvant combinée à l’injection de la toxine de la coqueluche. La capacité d’induire l’EAN dans la souche C57BL/6 permet l’utilisation des nombreux outils génétiques qui existent sur cette toile de fond la souris et permet ainsi l’étude sophistiquée de la pathogenèse de la maladie et à l’interrogatoire de l’action mécanique de thérapeutiques novatrices dans combinaison d’approches transgéniques. Dans cette étude, nous démontrons une approche simple pour provoquer avec succès l’EAN en utilisant le peptide de180-199 P0 chez les souris C57BL/6. Aussi, nous exposons un protocole pour l’évaluation des déficits fonctionnels qui se produisent dans ce modèle, accompagné d’un tableau de caractéristiques neuropathologiques. Ainsi, ce modèle est un puissant modèle expérimental pour l’étude de la pathogenèse de neuropathies démyélinisantes périphériques humains et pour déterminer l’efficacité des thérapies potentielles qui visent à favoriser la réparation de la myéline et protéger contre les dommages de nerf dans auto-immunes névrite.

Peptide de180-199 P0 induite par EAN dans des chenaux de souris C57BL/6 pour une maladie monophasique avec score clinique début de post 6 jours premier gravité score de vaccination (dpi) et maximale est observée du dpi 25 suivi par certains score clinique amélioration de 40 dpi durée (Figure 1)4,9. En termes de fonction de la démarche, les souris commencent à échouer à une tâche e...

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A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.

Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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