Name: a simple approach to induce experimental autoimmune neuritis in c57bl/6 mice for functional and neuropathological assessments
Uploaded: 2017-11-09T13:00:00
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DGG é um NHMRC Peter Doherty e companheiro de carreira precoce esclerose múltipla pesquisa Austrália (MSRA). JLF é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado MSRA. Este trabalho foi apoiado pelo Australian National Health e projeto de Conselho de pesquisa médica (NHMRC) conceder #APP1058647 JX.

todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Instituto de Florey de neurociência e Saúde Mental (centro do cérebro de Melbourne) Comitê de ética Animal e siga a australiana código de prática para o uso de animais para científico Fins.
 1. indução de EAN Nota: EAN pode ser induzido com sucesso em camundongos C57BL/6 do sexo masculino com idade entre 6-8 semanas. O protocolo de indução leva 9 dias no total. Dia 0 refere-se ao dia da primeira ...

<ol>
	<li>Newswanger, D. L., Warren, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barre+syndrome.">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).</li><li>Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+Guillain-Barre+syndrome+mortality+in+Spain+from+1999+to+2013.">Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013.</a> Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).</li><li>Walling, A. D., Dickson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barre+syndrome.">Guillain-Barre syndrome.</a> Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).</li><li>Gonsalvez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+and+Neuropathological+Testing+Paradigm+Reveals+New+Disability-Based+Parameters+and+Histological+Features+for+P0180-199-Induced+Experimental+Autoimmune+Neuritis+in+C57BL/6+Mice.">A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).</li><li>Berg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guillain-Barre+syndrome:+pathogenesis,+diagnosis,+treatment+and+prognosis.">Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis.</a> Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).</li><li>Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy--update+on+pathogenesis,+diagnostic+criteria+and+therapy.">Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy.</a> Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).</li><li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+the+motor-sensory+axonal+Guillain-Barre+syndrome.">Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome.</a> Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).</li><li>Taylor, W. A., Hughes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+neuritis+induced+in+SJL+mice+by+bovine+P2.">Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2.</a> J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).</li><li>Zou, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P0+protein+peptide+180-199+together+with+pertussis+toxin+induces+experimental+autoimmune+neuritis+in+resistant+C57BL/6+mice.">P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice.</a> J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).</li><li>Miletic, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P0(106-125)+is+a+neuritogenic+epitope+of+the+peripheral+myelin+protein+P0+and+induces+autoimmune+neuritis+in+C57BL/6+mice.">P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).</li><li>Hafer-Macko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+motor+axonal+neuropathy:+an+antibody-mediated+attack+on+axolemma.">Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma.</a> Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).</li><li>Griffin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+nodal+changes+in+the+acute+motor+axonal+neuropathy+pattern+of+the+Guillain-Barre+syndrome.">Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome.</a> J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).</li></ol>

Este relatório descreve um método simples para induzir EAN usando o peptídeo de180-199 P0 em camundongos C57BL/6, permitindo a quantificação dos principais défices neuropatológicas e funcionais em ratos induzidos com EAN. Distinto para o protocolo de indução de EAN descrito aqui é o uso de anestesia durante a realização das injecções de imunização. O uso de isoflurano anestesia realça extremamente a capacidade de assegurar que o volume total de inóculo é injetado por via subcutânea no local...

Neuropatias periféricas podem ser genético na origem ou adquiridos, com neuropatias adquiridas tendo ou metabólica, isquêmica, inflamatórias ou tóxicas precipitants. Estas doenças são também útil classificadas como axonal ou demyelinative na origem. O mais comum adquirida desmielinizantes neuropatias periféricas são aguda desmielinizante Polineuropatia inflamatória (AIDP, também conhecida como síndrome de Guillain-Barré, GBS) e crônica inflamatória desmielinizante polineuropatia (PDIC)1, 2 , 3 , 4; os dois pathogenetically são caracterizados por uma reação auto-imune contra a bainha de mielina, causando desmielinização dos nervos periféricos. Estas doenças, células T ativadas atravessam a barreira de sangue do nervo em geram uma reação imune dentro o PNS. Ativação de macrófagos dentro do nervo então causa desmielinização diretamente via fagocítica ataque ou indiretamente através de mediadores inflamatórios secretados, resultando em deficiências clínicas como paralisia e disfunção sensorial5. Enquanto axônios desmielinizados mantêm a capacidade de ser remyelinated seguindo a desmielinização, como muitas vezes é tardio ou incompleta, resultando em susceptibilidade dos axônios nus ao dano irreversível, que é a principal causa da clínica permanente Deficiência. Atualmente, os tratamentos mais eficazes são imunomodulador, mas apesar de sua eficácia, em muitos casos a recuperação é muitas vezes lenta e ~ 25% pacientes experimentarão residuais déficits funcionais que reduzem significativamente a sua qualidade de vida6, 7.
EAN é um modelo animal amplamente utilizado de desmielinizante neuropatia periférica que forneceu insights valiosos sobre patogênese e um meio para avaliar novos agentes terapêuticos4. Este modelo pode ser induzido em diferentes espécies, tais como coelhos, ratos, ratos e porquinhos da Índia e é induzida pela imunização com antígenos neurogênicos. No entanto, em última análise, a indução de EAN bem sucedida depende uma resposta imune adequada para doença ocorra. Tendo em conta as variações de espécies (e inter-species/tensão) na função imune, várias combinações de antígenos e adjuvantes foram desenvolvidas para induzir com êxito EAN. Em termos de ferramentas genéticas murino, a C57BL/6 é o mais utilizado; no entanto, o peptídeo de proteína P2 tradicional 57-81 (P257-81) que resulta em doença do suscetível SJL rato estirpe8 é incapaz de patogênese ilícito, levando a déficits funcionais na linhagem C57BL/6. Felizmente, paradigmas de sensibilização usando o P0106-125 ou P0180-199 peptídeos, entregue em adjuvante combinada com a injeção de coqueluche toxina pode superar essa barreira, permitindo que ferramentas sofisticadas de genéticas ser utilizada na modelo murino EAN.
Aqui, um método simples para a indução do EAN nos camundongos C57BL/6 é apresentado. Além disso, uma abordagem abrangente e detalhada por que avaliar os défices funcionais e neuropatológicas associados com a doença é fornecida. O P0180–199 peptídeo9 foi escolhido em preferência a alternativa de57-81 P010. O modelo de199 P0180–tem sido descrito para produzir sinais clínicos menos graves em comparação com a alternativa de57-81 P010e, portanto, susceptível de suportar a introdução de potencialmente perturbações genéticas deletérias, recuperar-se de procedimentos cirúrgicos (como implantação de bomba osmótica) e é passíveis de função de marcha de esteira teste4. No entanto, os testes de função da marcha de esteira e histológicos protocolos descritos aqui poderiam facilmente ser aplicados ao estudar a doença em uma variante de57-81 induzido P0.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6, male, 6-8 weeks old</td>
			<td>Australian Bioresources Cenre, WA, Australia</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc., CA, USA</td>
			<td>#181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Laboratories will have their own protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pharmachem, QLD, Australia</td>
			<td></td>
			<td>Laboratories will have their own protocol for administration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P0180&#8211;199 peptide</td>
			<td>Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN</td>
			<td></td>
			<td>P0180&#8211;199, sequence S&#8211;S&#8211;K&#8211;R&#8211;G&#8211;R&#8211; Q&#8211;T&#8211;P&#8211;V&#8211;L&#8211;Y&#8211;A&#8211;M&#8211;L&#8211;D&#8211;H&#8211;S&#8211;R&#8211;S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)</td>
			<td>Difco, MI, USA</td>
			<td>#231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#39;s complete adjuvant (FCA)</td>
			<td>Difco, MI, USA</td>
			<td>#263910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>#15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA day of tissue collection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% glutaraldheyde</td>
			<td>ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia</td>
			<td>#11-30-8</td>
			<td>Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td>
			<td>SL189</td>
			<td>Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia</td>
			<td>SA030</td>
			<td>Use at 30% (w/v).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) medium</td>
			<td>Sakura Finetek, CA, USA</td>
			<td>#4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore, MA, USA</td>
			<td>#S30-100</td>
			<td>Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma Aldrich, MI, USA</td>
			<td>#90o2-31-1</td>
			<td>Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)</td>
			<td>Invitrogen (Life Technologies), CA, USA</td>
			<td>S12700</td>
			<td>Used at 1:400 or titrate in own lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)</td>
			<td>Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel</td>
			<td></td>
			<td>Used at 1:500 or titrate in own lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies</td>
			<td>Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA</td>
			<td>Various</td>
			<td>Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting solution</td>
			<td>Dako (Agilent), CA, USA</td>
			<td>#S3023</td>
			<td>Each laboratory will have their own preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL syringe with 301/2 g needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>#326105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 g needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>#305143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red ink pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals&#39; feet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGate apparatus (includes treadmill)</td>
			<td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGate Imaging System</td>
			<td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any timer may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGait 8 Software</td>
			<td>eMouse Specifics Inc. Framingham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate dissecting microscope may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged slides</td>
			<td>Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd</td>
			<td>SF41296SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyrostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Any suitable cyrostat may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion equipment and dissecting instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Labs will have their own perfusion protoctols.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque humified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Labs may produce their own using an opaque plastic container.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pene</td>
			<td>GeneTex (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeis LSM780</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI/Image J</td>
			<td>National Institues of Health</td>
			<td></td>
			<td>Available from www.fiji.sc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple approach to induce experimental autoimmune neuritis in c57bl/6 mice for functional and neuropathological assessments

Neurite auto-imune experimental (EAN) é um modelo experimental bem apreciado de doenças desmielinizantes periféricas auto-imune. Doença EAN é induzida pela imunizar ratos com peptídeos neurogênicos para dirigir um ataque inflamatório para componentes do sistema nervoso periférico (SNP). Avanços recentes permitiram a indução de EAN na linha de rato relativamente resistente C57BL/6 usando proteína mielina zero (P0)106-125 ou P0180-199 peptídeos entregue em adjuvante, combinado com a injeção de toxina de coqueluche. A capacidade de induzir a EAN de estirpe C57BL/6 permite a utilização das inúmeras ferramentas genéticas que existem sobre este fundo de rato e assim permite que o sofisticado estudo da patogênese da doença e interrogatório da ação mecanicista da novela terapêutica em combinação com abordagens transgénicas. Neste estudo, vamos demonstrar uma abordagem simples para induzir com êxito EAN usando o peptídeo de180-199 P0 em camundongos C57BL/6. Também descrevem um protocolo para a avaliação dos défices funcionais que ocorrem neste modelo, acompanhado por um conjunto de características neuropatológicas. Assim, este modelo é um poderoso modelo experimental para estudar a patogênese das neuropatias desmielinizantes periféricas humanas e para determinar a eficácia de terapias potenciais que visam promover a reparação da mielina e proteger contra danos nos nervos em auto-imune neurite.

P0180-199 peptídeo induzida EAN em pistas de camundongos C57BL/6 para uma doença monofásica com escore clínico início do post 6 dias primeira imunização (dpi) e a máxima pontuação severidade é observada de dpi 25 seguido por alguns clínicos placar melhoria de 40 dpi duração (Figura 1)4,9. Em termos de função da marcha, os ratos começam a falhar logo em 6 dpi em uma simples ...

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A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Este relatório apresenta uma abordagem simples para induzir com êxito neurite auto-imune experimental (EAN) usando a proteína mielina zero peptídeo de180-199 (P0) em combinação com adjuvante completo de Freund e coqueluche toxina. Apresentamos um paradigma sofisticado capaz de avaliar com precisão a extensão dos défices funcionais e neuropatologia que ocorrem neste EAN.

Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

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