Name: visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة موناش والصحة الوطنية، ومجلس البحوث الطبية، والرئة موناش ومعهد النوم. الكتاب أود أن أشكر موظفي "المناعة السريرية" في الصحة موناش، جودي كالاهان وأليكس فوشيه، كيرستين الجاس وكامدن لو من موناش الصغرى التصوير (MMI) للحصول على تعليمات مع المجهرية [كنفوكل] التصوير، وتقر الكتاب المرافق MMI جامعة موناش. يعترف الكتاب المرافق، وتقديم المساعدة العلمية والتقنية من "منهاج علم الأنسجة موناش".

هذا البروتوكول يتبع التجارب التي تمت الموافقة عليها في: (1) البشر "أخلاقيات اللجنة من موناش الطبي المركز"، والحيوانات (2) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة ملبورن.
 1-الضامة للفيسيولوجيا الغسل (BAL) <ol><li>"باستخدام ال" الحصول على الضامة الرئة في: الإنسان (1) مواضيع بالقصبات ...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1 (2013).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).</li><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PAD4+in+NET+formation.">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360 (2012).</li><li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation.">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li><li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling/Mechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema.">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li><li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host &amp; microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis.">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li></ol>

ويستند الأسلوب الموصوفة في هذا الاستعراض على أن تستخدم لتحديد وجود شبكات14. الضامة تعتبر إلى حد بعيد نوع الخلية المهيمنة في عينات بال وهذا الأسلوب من جمع خاصة مناسبة لدراسة ميتس. إذا كانت خلايا الدم الحمراء موجودة في ال، ينبغي تفكيك هذه الخلايا باستخدام كلوريد الأمونيوم. سيتم ...

ووصفت الفخاخ خارج الخلية العَدلات (شبكات)، أولاً برينكمان et al. 1 يتم إنتاجها في الغالب استجابة للعدوى (خاصة للبكتيريا) ولها دور هام في الدفاع المضيف1،2. قد وصفت أيضا تحدث استجابة للأمراض غير المعدية، بما في ذلك التهاب الأوعية الدموية والذئبه الحمامية الجهازية (SLE)؛ وإلى mitogen phorbol 12-ميريساتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)2،3. وقد اعترف مؤخرا أن أنواع الخلايا الأخرى قد تنتج أيضا الفخاخ خارج الخلية، بما في ذلك الضامة. بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس) ليست بعد كيان محدد جيدا في الأدب4،5. وقد أنشأنا مؤخرا أساليب الكشف عن وجود ميتس في المختبر و في فيفو6،7. في هذه المقالة، سيتم وصف قياس ميتس استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
السمات الرئيسية نيتوسيس التي تميزها عن سائر المسارات الخلوية (مثل المبرمج8) هي النتوء الكروماتين بالاقتران مع: (1) سيترولينيشن هيستونيس (H3Cit)9، (2) التعبير المشارك من البروتياز الحبيبية10 ، ومشاركة بيبتيديل ارجينين ديميناسي (PAD) 4 (3)11،12. الضامة أيضا أن أعرب عن H3Cit، البروتياز الحبيبية، ومنصة، ويمكن استخدام هذه الميزات لتحديد وجود ميتس.
قد يكون ميتس دوراً بالغ أهمية في الرئة، كما بلعم هو المهيمن الخلية الحالية في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية في الرئة والدور الأولى في توجيه الاستجابة المناعية الخلوية للعدوى/التهاب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الكثير من الرئة مساحة فارغة (مثلاً، داخل الحويصلات الهوائية)، ميتس، يحتمل أن تكون قادرة على التوسع في المساحة المتوفرة، على النقيض من الأجهزة الصلبة.
الأسلوب الأكثر استخداماً لتحديد وجود شبكات بالفحص المجهري [كنفوكل]. لا توجد حتى الآن طريقة محددة بوضوح لقياس ميتس. هذه التقنية لقياس شبكات تم تكييف لقياس وجود ميتس في هذا البروتوكول. المتطلبات الرئيسية لهذا الأسلوب هي الوصول إلى الفحص المجهري [كنفوكل] وبرامج التصوير المناسبة للتحليل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human MMP12</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>NB110-57214</td>
			<td>1:100 concentration not quantifiable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MMP9</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>AB119906</td>
			<td>1:200 ascites, no concentration given</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human PADI2/PAD2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB16478</td>
			<td>7 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NE</td>
			<td>LifeSpan Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse samples: Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse MMP9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AF909</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB5103</td>
			<td>10 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>In-house (hybridoma)</td>
			<td>In house</td>
			<td>20 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human Anti-HNE /NE</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>LS-B4244</td>
			<td>25 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human &#173;&#173;&#173;&#173;PADI4/PAD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB128086</td>
			<td>10.1 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-frost plus slides</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>S41104A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-prolong gold</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-rabbit AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-goat AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>a-21468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-mouse AF 647</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-21463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-sheep AF 594</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A-11016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>550878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep IgG</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Programs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV1200 Confocal scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue sources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>r8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan black</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K2753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent 3B</td>
			<td>Hi-Chem</td>
			<td>2026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 x 24 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c57 black 6</td>
			<td>Monash animal research platform (MARP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c</td>
			<td>MARP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy

وسيلة الرئيسية المستخدمة لتحديد وجود العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) [كنفوكل] مجهرية. وقد قمنا بتعديل أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] ثابتة لتصور بلعم الفخاخ خارج الخلية (ميتس). يتم تعريف هذه الفخاخ خارج الخلية بوجود الكروماتين خارج الخلية مع التعبير المشترك لمكونات أخرى مثل البروتياز الحبيبية وهيستونيس سيتروليناتيد بيبتيديل أرجيناسي ديميناسي (PAD). التعبير عن ميتس عموما يقاس بعد التعرض لحافز ومقارنة عينات تنشيط الأمم المتحدة. عينات مدرجة أيضا للتحكم بالخلفية وايستب. ويتم تحليل الخلايا باستخدام برمجيات التحليل صورة واضحة المعالم. يمكن استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد وجود ميتس على حد سواء في المختبر و في فيفو في أنسجة الرئة.

وقد تصور ميتس من عينات BAL، في أنسجة الرئة وفي أقسام الرئة أكثر سمكا مع صور ثلاثية الأبعاد. ويرد مثال ميتس تصور في عينة بال في الشكل 1. مورفولوجية ميتس ستختلف وفقا لمرحلة النضج. أول ميزة يمكن كشفها في الفحص المجهري هو حركة نواة إلى الحافة من الخلية. ويعقب هذا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

بلعم الفخاخ خارج الخلية كيان وصف حديثا. هذه المادة سوف تركز على أساليب الفحص المجهري [كنفوكل] وكيف أنها تصور في المختبر و في فيفو من عينات الرئة.

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

The overall goal of this method is to demonstrate how macrophage extracellular traps can be visualized and studied using confocal microscopy. This method can help answer key questions in the inflammation field, such as responses to infection and other immune stimuli. The main advantage of this technique is that it is a modification of a well established method that has been used to study neutrophil extracellular traps.Demonstrating this procedure will be Roleen Sharma. After obtaining lung macrophages from humans and mice by bronchoalveolar lavage, or BAL, according to the text protocol, use trypan blue and a hemocytometer to perform a viable cell count on the BAL solution. Pipette one to four times 10 to the fifth macrophages in 500 microliters of culture medium onto cover slips in the wells of 24-well plates, then incubate the cells at 37 degrees Celsius overnight for the cells to adhere.Remove the culture medium and use PBS to wash the cells once. Then add 2%paraformaldehyde-periodate-lysine, or PLP fixative, and incubate the samples for 10 minutes. After using PBS to briefly wash the cells, add 0.2%TWEEN 20 in PBS and incubate the cells for 20 minutes.Next, to block the cells, add 10%chicken serum in 5%BSA, diluted in PBS and incubate the samples at room temperature for 30 minutes. Then replace the block solution with a one to 100 concentration of primary and isotope control antibodies and incubate the cells at room temperature for one hour. Following the incubation, use PBS to wash the cells before adding the corresponding secondary antibodies.Then incubate the samples for 40 minutes at room temperature. After washing the cells in PBS, mount the samples with DAPI based mounting medium, then visualize the samples using a confocal microscope. To pretreat the FFPE samples with antigen retrieval solution, oven dry the slides at 60 degrees Celsius for 60 minutes.Then transfer the slides into xylene solution for 30 minutes before transferring the samples to 70%ethanol at room temperature for five minutes. After using tap water to rinse the slides, place them in heat-proof plastic wrap and subject them to higher antigen retrieval by placing them in a pressure cooker in Tris-EDTA pH 9.0 for 10 minutes. Cool the samples for 20 minutes and transfer them to tap water.Then place them on a rocker for five minutes. Repeat the tap water wash and then wash the slides once in PBS on the rocker. To block the samples, add 10%chicken serum in 5%BSA PBS and incubate them at room temperature for 30 minutes.Then, to define macrophage extracellular traps, or METs in macrophages, add a one to 100 dilution of primary antibodies in 1%BSA PBS and incubate the slides at four degrees Celsius for 16 hours. Use PBS to wash the samples two times on a rocker for five minutes each. Add the corresponding fluorescent secondary antibodies in 1%BSA PBS and incubate the slides at room temperature for 40 minutes.Following PBS washes, use DAPI containing mounting medium to stain the chromatin and mount the samples. Using a confocal laser scanning head attached to an inverted microscope, capture fluorescent images using 20X 0.1 NA air and 40X 1.0 NA oil objectives. Capture single plane 512 by 512 pixel images by clicking on the Line Sequential leveling button.Obtain at least 10 fields of view per section for analysis and data for each result. To stain the sections in microcentrifuge tubes, add the relevant primary antibodies in 200 microliter volumes and incubate the samples at four degrees Celsius for 16 hours. Wash the sections in PBS three times for 10 minutes before adding the appropriate secondary antibodies and incubating the samples at room temperature for one hour.Use DAPI to stain the lung sections in solution and incubate the samples for 20 minutes before adding cover slips to the sections on microscope slides in PBS. Use an inverted confocal microscope with a 40X 1.3 NA objective, equipped with 405 nanometers, 440 nanometers, 473 nanometers, 543 nanometers, and 635 nanometer lasers, to capture images and to record 3D Z stacks, 0.54 microns thick, with optimal Z sectioning. Finally, analyze the images according to the text protocol.An example of METs in a BAL sample is shown here. The first detectable feature is the movement of the nucleus to the edge of the cell, as seen in this earlier stage MET that has a roughly spherical shape. This is followed by extracellular chromatin with other co-expressed mediators, such as H3Cit and granular proteases, as seen in this more mature MET.Earlier stage MET is upper left and later stage MET is below this towards the center. Lung tissue METs are shown in this figure. As the lungs are inflated with fluid to define the lung architecture, the METs will be pushed against the alveolar walls.The morphology of the METs will also vary depending on in which plane the tissue was cut. The standard sections used for lung tissue samples are four to five microns thick. Thicker tissue sections enable multiple images to be taken and the METs can then be viewed in 3D.An example of a 3D image from mouse lung tissue cut in 25 to 35 micron sections is presented here. Once mastered, this technique can be done in two days of staining plus imaging if it's performed properly. While attempting this procedure, it is important to remember to be gentle with the washes.Following this procedure, other methods like zymography can be performed to answer additional questions like protease expression. After its development, this technique may pave way for the study of inflammatory macrophage responses. After watching this video, you should have a good understanding of how to visualize METs using confocal microscopy.Don't forget that working with PLP can be hazardous and precautions such as wearing gloves and eye protection should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...