Name: methods to study changes in inherent protein aggregation with age in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos de la DZNE y una beca de reinserción Marie Curie Internacional (322120 a D.C.D.)

Nota: Para una mejor comprensión del procedimiento, se adjunta un esquema del flujo de trabajo (figura 1).
1. crecimiento de grandes números de jóvenes y de C. elegans sometidos a ARNi dirigido a un gen de interés
Nota: Uso de C. elegans por temperatura estéril gon-2(q388) mutantes (CF2253) para obtener grandes poblaciones de crianza sincronizada. Durante todos los pasos, es importante trabajar bajo condici...

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>David, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+the+aggregating+proteome.">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles.">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li><li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans.">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450 (2010).</li><li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO/4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging.">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li><li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Insulin/IGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging.">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li><li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan.">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li><li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation.">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311 (2016).</li><li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans.">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li><li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue.">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li><li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans.">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li><li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans.">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).</li><li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans.">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).</li><li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans:+uses+and+cautions.">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li><li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics.">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li><li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans.">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li><li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+genetic+methods.">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li><li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li><li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li><li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset.">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964 (2014).</li><li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans.">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li><li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance.">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li><li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females.">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).</li><li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions.">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li><li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans.">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).</li><li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases.">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS/FOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators.">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li><li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+brain,+CSF,+and+plasma+amyloid+(beta)+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li><li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy.">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li></ol>

Aquí se presenta una metodología para aislar a agregados de proteína altamente insoluble de envejecimiento C. elegans sometidos a ARNi para análisis por espectrometría de masas y Western blotting. Mostramos que mejorar proteostasis reduciendo grandemente IIS previene la agregación de proteínas dependientes de la edad. Por selección de proteínas específicas propensas a la agregación que sobreexpresan en C. elegans, es posible disecar más los mecanismos de modulación de agregación de la prot...

Agregación y mal plegamiento de proteínas son reconocidas como una seña de identidad de varias enfermedades neurodegenerativas tales como AD, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD) y muchos otros. Por ejemplo, asambleas de α-sinucleína en fibrillas amiloides que se acumulan como los cuerpos de Lewy particularmente en el nigra del substantia de los pacientes con EP, mientras que en misfold de TDP-43 o FUS de pacientes ALS para formar agregados citoplasmáticos en degeneración de las neuronas motoras. En cada uno de estos trastornos neurodegenerativos, mecanismos de mantenimiento de la homeostasis de proteínas o proteostasis no evitar la acumulación de proteínas mal plegadas, por lo tanto conduce a la enfermedad.
Proteostasis es crucial para las funciones celulares y bajo condiciones normales estos mecanismos controlan firmemente la tasa de síntesis de proteínas, plegamiento y degradación. Varios estudios demuestran que con el envejecimiento, la capacidad de muchas células y órganos para mantener la homeostasis de proteínas poco a poco se ve comprometida y el deterioro fisiológico de las redes proteostasis con la edad es un factor agravante importante para enfermedades neurodegenerativas (revisadas en las referencias1,2,3). El hecho de que el control de calidad de la proteína y la respuesta celular al estrés proteínas desplegadas se comprometen con la edad sugiere que el mal plegamiento de proteínas y agregación podrían ser una general consecuencia del envejecimiento. De hecho, nosotros y otros hemos demostrado que la agregación de la proteína no se limita a la enfermedad y en cambio parte del proteoma se convierte en altamente insoluble en detergente en animales envejecidos4,5,6,7 ,8,9,10. Análisis computacional e in vivo revelaron que estos agregados relacionados con la edad fisiológicos se asemejan a agregados de la enfermedad en varios aspectos5. El descubrimiento de la agregación de proteína endógena, dependiente de la edad nos da la oportunidad de diseccionar los mecanismos moleculares y celulares que regulan la agregación de proteínas, sin utilizar ectopically expresadas proteínas humanas asociadas a la enfermedad. En la actualidad, solamente poca información existe sobre la regulación de la insolubilidad de la proteína generalizada y sobre los efectos de esta disregulación en la salud del organismo.
El nematodo C. elegans es uno de los organismos modelo más extensamente estudiados en la investigación del envejecimiento ya que estos animales tienen una vida útil relativamente corta y muestran muchas características de envejecimiento característico observados en organismos superiores. Los efectos del envejecimiento en la insolubilidad de la proteína han sido estudiados en C. elegans por fraccionamiento bioquímico secuencial basado en la solubilidad diferencial, que es ampliamente utilizado para extraer áridos de la enfermedad en el campo de la investigación neurodegeneración11 . Por espectrometría de masa cuantitativa, varias cientos proteínas fueron demostradas para ser agregación-propensa en C. elegans en la ausencia de enfermedad5. Aquí describimos en detalle el protocolo para cultivar grandes cantidades de gusanos en cultivo líquido y la extracción secuencial para aislar proteínas agregadas para la cuantificación por espectrometría de masas y el análisis por Western blot. Porque las proteínas mal plegadas y propensas a la agregación se acumulan en mayores cambios de gónadas y máscaras de C. elegans en otros tejidos somáticos5,12,13, utilizamos un mutante de la gónada menos centrarse el análisis de proteínas insolubilidad en los tejidos no reproductivos. El método permite el análisis de los agregados altamente insoluble, grandes que son insolubles en 0,5% SDS y sedimentados por la relativamente baja velocidad centrífuga. Por otra parte, un protocolo de extracción menos riguroso para recoger también agregados más pequeños y más solubles ha sido publicado en otra parte10. Además, se describe el método utilizado para evaluar la agregación en vivo en C. elegans.
En general, estos métodos en combinación con el ARN de interferencia (ARNi) pueden evaluar la función de un gen de interés en la modulación de agregación de la proteína depende de la edad. Para ello se describe el análisis de extractos de gusanos jóvenes y mayores con y sin precipitación de una proteína específica de interés utilizando RNAi. Estos métodos deben ser una herramienta poderosa para determinar que los componentes de la red proteostasis regulan insolubilidad de la proteína. Varias intervenciones tales como reducción la insulina/insulina-like growth factor (IGF) 1 señalización (IIS) se ha demostrado que retrasar dramáticamente C. elegans envejecimiento14. Vías de longevidad a menudo inducen mecanismos de control de calidad de la proteína y así estas vías podrían ser activamente influir en la tasa de agregación de la proteína. Por ejemplo, nos demuestran agregación reducida proteína inherente en animales de larga vida sobre la inhibición de la vía IIS7.

<table style="border-collapse:collapse;width:635pt" width="847">
	<colgroup>
		<col style="width:161pt" width="215" />
		<col style="width:92pt" width="122" />
		<col style="width:258pt" width="344" />
		<col style="width:125pt" width="166" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fernbach culture flask&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Corning</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344">4425-2XL</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Membrane Screw Cap&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Schott</td>
			<td class="xl19">1088655</td>
			<td class="xl17">GL45</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nutating Mixer</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">VWR</td>
			<td class="xl19">444-0148</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Separatory funnel</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Nalgene</td>
			<td class="xl19">4300-1000</td>
			<td class="xl17">Capacity 1,000 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">1 ml syringe&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Plastipak</td>
			<td class="xl19">300013</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Gray needle, 27 G x &#189; &#34;, 0.4 mm x 13 mm</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">BD Microlance 3</td>
			<td class="xl19">300635</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Membrane filters 0.025 &#181;M</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Millipore</td>
			<td class="xl19">VSWP04700</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">pH strip</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Machery-Nagel</td>
			<td class="xl19">92110</td>
			<td class="xl17">pH-Fix 0-14</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">4693132001</td>
			<td class="xl16" style="width:125pt" width="166">Complete Mini EDTA-free tablets&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Octoxynol-9&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1388</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">M1317</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Nonylphenylpolyethylenglycol</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Applichem</td>
			<td class="xl19">A1694</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Nonidet P40 (NP40)</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">DNaseI</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Roche</td>
			<td class="xl19">04716728001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">recombinant, RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">RNaseA</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl19">A7973</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">solution</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein blot staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S11791</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein blot stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Total protein gel staining</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermofisher</td>
			<td class="xl19">S12001</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">Sypro Ruby protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">36970</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Iodoacetamide</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Serva</td>
			<td class="xl19">26710</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Ammoniumbicarbonate</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl19">09830</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Promega</td>
			<td class="xl25" style="width:258pt" width="344">V5111</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Isobaric tags for relative and absolute quantitation</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Sciex</td>
			<td class="xl19">4352135</td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">iTRAQ Reagents Multiplex Kit</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Avanti J-26XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393126</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Ultracentrifuge Optima Max-XP</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Beckmann Coulter</td>
			<td class="xl19">393315</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5424R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5404000413</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge 5702</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5702000329</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Centrifuge Megafuge 40R</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl19">75004518</td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Concentrator Plus</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Eppendorf</td>
			<td class="xl19">5305000304</td>
			<td class="xl17">Centrifugal evaporator</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Fluorescent stereo-microscope M165 FC&#160;</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl18" style="width:125pt" width="166">With Planapo 2.0x objective</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Dissection microscope</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Leica&#160;</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17">Leica S6E</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:161pt;height:60.0pt" width="215">High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td class="xl18" height="80" rowspan="2" style="width:92pt;height:60.0pt" width="122">Zeiss</td>
			<td class="xl19" height="80" rowspan="2" style="width:258pt;height:60.0pt" width="344"></td>
			<td class="xl16" height="80" rowspan="2" style="width:125pt;height:60.0pt" width="166">With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">Software</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl32"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">Image analysis software</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">ImageJ</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl18" height="40" style="width:161pt;height:30.0pt" width="215">Analysis of mass spectrometry data</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Protein Prospector</td>
			<td class="xl136" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl137">http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">E.coli strain</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">OP50</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl32" height="40" style="height:30.0pt">RNAi bacteria</td>
			<td class="xl33" style="width:92pt" width="122"></td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl17" height="40" style="height:30.0pt">L4440</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">Julie Ahringer RNAi library</td>
			<td class="xl19"></td>
			<td class="xl17"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans mutants</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl17" height="42" style="height:31.5pt">CF2253</td>
			<td class="xl18" style="width:92pt" width="122">CGC, strain name: EJ1158&#160;</td>
			<td class="xl40" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl17">Genotype: gon-2(q388)</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">C. elegans transgenics</td>
			<td class="xl33" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122"></td>
			<td class="xl32" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl18" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD214</td>
			<td class="xl25" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl17" height="42" rowspan="2" style="width:161pt;height:31.5pt" width="215">DCD215</td>
			<td class="xl87" height="42" rowspan="2" style="width:92pt;height:31.5pt" width="122">Della David&#39;s lab at DZNE T&#252;bingen</td>
			<td class="xl40" height="42" rowspan="2" style="width:258pt;height:31.5pt" width="344"></td>
			<td class="xl68" height="42" rowspan="2" style="width:125pt;height:31.5pt" width="166">Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study changes in inherent protein aggregation with age in caenorhabditis elegans

En las últimas décadas, la prevalencia de trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y enfermedad de Parkinson (EP), ha crecido. Estos trastornos asociados con la edad se caracterizan por la aparición de agregados de proteínas de estructura fibrilar en los cerebros de estos pacientes. Exactamente por qué proteínas solubles normalmente se someten a un proceso de agregación sigue siendo mal entendido. El descubrimiento que la agregación de la proteína no se limita a procesos de la enfermedad y en su lugar parte del proceso normal de envejecimiento permite el estudio de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la agregación de proteínas, sin utilizar ectopically expresado humana proteínas asociadas a la enfermedad. Aquí se describen metodologías para examinar la agregación de proteínas inherentes en elegans de Caenorhabditis a través de enfoques complementarios. En primer lugar, examinamos cómo cultivar grandes cantidades de edad-que sincronizados C. elegans para la obtención de animales y presentamos los procedimientos bioquímicos para aislar altamente insoluble en grandes agregados. En combinación con una caída genética dirigida, es posible diseccionar el papel de un gen de interés en la promoción o prevención de la agregación de proteínas dependientes de la edad usando ya sea un análisis exhaustivo con espectrometría de masas cuantitativo o una Análisis basado en el candidato con los anticuerpos. Estos resultados son luego confirmados por análisis en vivo con animales transgénicos expresando con etiquetas fluorescentes propensas a la agregación de proteínas. Estos métodos deberían ayudar a aclarar por qué ciertas proteínas son propensos a agregado con la edad y, en definitiva, cómo mantener estas proteínas completamente funcional.

Utilizamos los métodos aquí presentados para evaluar cómo longevos animales con menor IIS modulan la agregación de proteínas dependientes de la edad. Por Western blot (vea el paso 2.2, rápida extracción de la proteína insoluble para el análisis de Western blot), analizamos el total y el contenido de proteína insoluble de jóvenes (día 3 de la edad adulta) y de gusanos (día 18 de la edad adulta) control de RNAi y de ARNi a la insulina / Receptor de IGF-1-como daf-2. Ob...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

El método presentado aquí pretende explorar la agregación de proteínas durante el envejecimiento normal en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. El protocolo representa una poderosa herramienta para el estudio de los agregados grandes altamente insolubles que se forman con la edad y determinar cómo cambios en proteostasis impactan de agregación de la proteína.

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Research

JoVE Journal

Biology

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Investigación

Biología

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

En Vitro agregación ensayos usando hiperfosforilada proteína tau

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

El cultivo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En tres dimensiones en el Laboratorio

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modelar enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad en Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...