Name: a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00
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著者は、ご提供する試薬およびマウスの博士 Minghan トンと加藤をありがとうございます。私たちは有益な議論のゾウの研究室のメンバーに感謝します。この作品は一部の助成金によって支えられた 973 プログラム中国の省の科学と技術 (ほとんど) [2014CB964704、2015CB964503] からの第 9 人民病院、上海 Jiao はさみ大学医学部の臨床研究プログラム。細胞生物学および生物化学の中核施設、上海生物化学および細胞生物学、中国科学アカデミー研究所分子細胞科学の卓越性のための CAS センターの中核施設の助けをありがとう。

動物に関する各種手続きスタンフォード紛争処理パネル研究所動物ケア (APLAC) のによって承認されたプロトコルに従って行われ、動物愛護、上海研究所の生化学と細胞の利用委員会によって承認されました。生物学。
1. 準備
<ol><li>破骨細胞特定ラプター削除マウス (ラプターフロリダ州/フロリダ; を生成します。Ctsk cre、 Ctskラッ?...

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+bone+remodeling.">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li><li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts.">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li><li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells.">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells.">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li><li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+TORCs+and+Akt.">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+(Raptor)/Mammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+(mTORC1)+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice.">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow.">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056 (2014).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells.">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li><li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand.">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast?.">From where comes the osteoclast?.</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li><li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3.">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li></ol>

Osteoclastogenic アッセイは、分離と培養破骨細胞の in vitro12,13最も広く使われている方法です。いくつかの RANKL による破骨細胞誘導説明13,14,15をされているが、本研究は、いくつかの変更は、以前の方法に基づくプロトコルを説明します。
以前の研究で?...

骨は絶えず変化する臓器で、骨芽細胞と破骨細胞は生涯で改造します。破骨細胞は、無機マトリックス吸収と骨芽細胞が合成し、新しいボーン行列1を分泌します。骨吸収と骨形成のバランスは骨の維持を含む骨の健康にとって重要な質量と刺激や損傷に応答します。このバランスを中断すると、骨粗鬆症と歯周疾患を含む、一連の骨代謝性疾患が発生します。これらの疾患では、破骨細胞性骨吸収による骨の質量損失は骨形成骨芽細胞2,3の容量を超えています。したがって、骨粗鬆症など骨格の疾患を治療する医薬品ターゲットを開発するために、世代や4破骨細胞の生物学を理解する重要です。
破骨細胞または骨の表面近くにあるユニークな巨大な多核巨細胞の細胞、単球/マクロファージ家族1に属する。イボットソン k. j.ら1, 25-ジヒドロキシ ビタミン D35を含む培地で培養破骨細胞様細胞を生成する手法について報告します。破骨細胞形成の本質的な要因としてマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体を活性化因子の同定には破骨細胞形成体外の効率が大幅に増加します。1,6,7. 世代の我々 の理解と破骨細胞の制御に培養破骨細胞の in vitroに能力は向上します。
2 つの構造的、機能的に異なる錯体、すなわち mTORC1、mTORC28,9ラパマイシン標的 (mTOR) 関数の哺乳類/機構対象。2 つの多蛋白質の複合体は異なった部品および下流の基板による互いから区別されます。mTORC1 には mTORC2 には mTOR (Rictor)9のラパマイシンを区別しないコンパニオンが含まれている mTOR (ラプター) のユニークな規制関連タンパク質が含まれています。mTORC1 は統合し、細胞の増殖、増殖と分化の調節に重要な信号を送信できます。最近、その mTORC1 破10で mTORC1 を不活化するラプターの削除によって異化骨吸収のネットワーク キー役割を果たしてデモンストレーションを行った。ただし、基になるメカニズムのさらなる研究が必要です。野生型 (WT) とラップのCtskマウスの骨髄由来マクロファージ (BMMs) から破骨細胞を生成し、破骨細胞に mTORC1 不活性化の影響を研究する本研究 RANKL ベースの osteoclastogenic メソッドを使用しました。形成します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Raptorfl/fl mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>BioInd</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse M-CSF protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3U4F9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse RANKL protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3TWY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC Base solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tartaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Raptor</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ribosomal protein S6</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-130300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>Xilong scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>00000367MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-mm Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

破骨細胞が骨吸収をユニークな細胞を骨髄単球/マクロファージ系統から分化します。破骨細胞の機能不全、骨粗鬆症を含む骨代謝疾患のシリーズあります。病的骨の質量損失の防止のための医薬品のターゲットを開発するには、破骨細胞を前駆体から区別するメカニズムが理解されなければなりません。分離し、培養破骨細胞の多数の文化能力は破骨細胞分化における特定遺伝子の役割を決定するために重要です。破骨細胞の複雑な 1 (TORC1) ラパマイシンの哺乳類/機構のターゲットの不活化する破骨細胞数が低下し、骨の量を増やすただし、基になるメカニズムのさらなる研究が必要です。本研究では RANKL ベースのプロトコルを分離し、培養マウス骨髄から破骨細胞と破骨細胞形成における mTORC1 不活性化の影響を研究する、説明します。このプロトコルは正常に 1 週間以内通常巨大な破骨細胞の多数で起因しました。ラプターの削除は、破骨細胞形成を障害者し、その mTORC1 が破骨細胞形成のためクリティカルを示す分泌の酒石酸耐性酸性ホスファターゼの活性が低下します。

現在のプロトコルを使用して、巨大な破骨細胞の数が多いは、6; の日に見られました。巨大な破骨細胞を見ていない場合破骨細胞分化の 1 つのより多くの日があります (図 1) を必要とします。成功した破骨細胞形成は、TRAP 染色 (図 2 a) によって確認されました。破骨細胞以上 3 核の巨大ワイン赤/紫細胞はあった。WT BMMs (<s...

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A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

本稿では、マウスの骨髄から破骨細胞形成の複雑な 1 ラパマイシンの哺乳類/機構のターゲットの役割を研究する分離と培養破骨細胞の in vitroにプロトコルについて説明します。

RANKL による破骨細胞文化アッセイのマウス骨髄破骨細胞形成における mTORC1 の役割を調査するには

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

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