Name: an array-based comparative genomic hybridization platform for efficient detection of copy number variations in fast neutron-induced medicago truncatula mutants
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutant

Financiamento deste trabalho é fornecido em parte por uma concessão do NSF planta Genome Research (IOS-1127155).

Nota: a Figura 1 mostra as cinco etapas para a matriz de protocolo CGH. Eles são: 1) preparação dos materiais de planta; 2) o isolamento de amostras de DNA de alta qualidade; 3) rotulagem e purificação de amostras de ADN; 4) hibridização, lavagem e varredura de matrizes de genoma inteiro; e 5) a análise dos dados CGH. Matrizes de azulejos de genoma inteiro M. truncatula contêm um total de 971.041 prova de oligo exclusivo visando a mais de 50.000 genes ou modelos de gene n...

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	<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+genome+release+(version+Mt4.0)+for+the+model+legume+Medicago+truncatula.">An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula.</a> BMC Genomics. 15, 312 (2014).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+composition+and+origins+of+genomic+variation+among+individuals+of+the+soybean+reference+cultivar+Williams+82.">The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82.</a> Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).</li><li>Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+amplifications+caused+by+chromosomal+rearrangements+play+a+major+role+in+the+adaptive+evolution+of+natural+yeast.">Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast.</a> Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).</li><li>Jones, M. R., Maydan, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide+Array+Comparative+Genomic+Hybridization+(oaCGH)+based+characterization+of+genetic+deficiencies+as+an+aid+to+gene+mapping+in+Caenorhabditis+elegans.">Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 8, 402 (2007).</li><li>Lakshmi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genomic+representational+oligonucleotide+microarray+analysis:+detection+of+copy+number+variations+in+normal+and+tumor+specimens.">Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).</li><li>Mitra, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+required+for+symbiotic+nodule+development:+Gene+identification+by+transcript-based+cloning.">A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).</li><li>Rios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hemizygous+deletions+in+citrus+using+array-comparative+genomic+hybridization+and+microsynteny+comparisons+with+the+poplar+genome.">Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome.</a> BMC Genomics. 9, 381 (2008).</li><li>Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+expression+arrays+for+copy+number+detection:+an+example+from+E.+coli.">Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli.</a> BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).</li><li>Werner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+locus+mapping+and+DNA+array+hybridization+identify+an+FLM+deletion+as+a+cause+for+natural+flowering-time+variation.">Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).</li><li>Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. 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P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+truncatula+SUNN+gene+encodes+a+CLV1-like+leucine-rich+repeat+receptor+kinase+that+regulates+nodule+number+and+root+length.">The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length.</a> Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).</li><li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide,+NCR169,+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant.">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis.">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li><li>. Medicago truncatula Mutant Database Available from: <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017)</li><li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray.">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li></ol>

Nós desenvolvemos uma plataforma CGH baseada em array para a detecção e caracterização de bombardeamento de neutrões rápidos (FNB)-induzido mutantes em M. truncatula CV Jemalong A17. Para demonstrar o uso da matriz método CGH na detecção de mutações genéticas, realizamos análise de protocolo do mutante FN6191, que exibiu um fenótipo de hipernodulação em contraste com plantas de tipo selvagem, quando inoculados com S. tem Sm1021. Para a análise de segmentação, um segmento foi consider...

Leguminosas (Fabaceae) são a terceira maior família de plantas, com muitas espécies economicamente importantes, tais como a soja (Glycine max) e alfafa (Medicago sativa). Os legumes podem interagir com bactérias fixadoras de nitrogênio solo, geralmente chamado de Rhizobia desenvolver nódulos de raiz no qual o dinitrogênio atmosférico é reduzido a amônia para uso pela planta hospedeira. Como tal, o cultivo de culturas de vegetal requer pouca entrada de fertilizantes nitrogenados e, portanto, contribui para uma agricultura sustentável. Culturas de vegetal produzem folhas e sementes com conteúdo de alta proteína, servindo como forragem excelente e colheitas de grão. No entanto, a espécie vegetal cultivada geralmente têm estruturas complexas do genoma, fazendo estudos funcionais de genes que desempenham papéis-chave em processos específicos de vegetal pesados. Medicago truncatula foi adotado extensamente como uma espécie de modelo para estudos de vegetal principalmente porque (1) ele possui um genoma diploide com um tamanho relativamente pequeno genoma haploide (~ 550 Mbp); (2) plantas estàvel transformam-se para estudos funcionais do gene; e (3) que está intimamente relacionado com alfafa (M. sativa), a rainha das forragens e muitas outras culturas economicamente importantes para estudos de translação. Recentemente, a sequência do genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 tem sido lançado1,2. Anotação do genoma mostra que existem mais de 50.000 genes previstos ou modelos de gene no genoma. Para determinar a função da maioria dos genes do M. truncatula genoma é uma tarefa desafiadora. Para facilitar estudos funcionais de genes, uma coleção abrangente de mutantes no intervalo de mais de 150.000 M1 linhas foi gerada usando o mutagenesis de bombardeio (FNB) nêutrons rápidos em M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Nêutron rápido, um agente mutagénico ionização de alta energia, tem sido usado na geração de mutantes em muitas espécies de plantas, incluindo Arabidopsis5,6, arroz (Oryza sativa)7, tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. máx)8,9, cevada (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Uma grande parte das mutações derivadas de mutagénese FNB são devido a exclusões de DNA que variam em tamanho de alguns pares de bases a mega pares de base9,11. Muitos genes associados fenótipo foram com êxito identificado e caracterizado4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, clonagem molecular dos genes subjacentes de mutantes FNB baseou-se em uma abordagem baseada em mapa, que é demorado e limita o número de mutantes para ser caracterizada a nível molecular. Recentemente, várias abordagens complementares, incluindo métodos baseados em transcrição, genoma telhar hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) para detecção de variação número do DNA cópia e sequenciamento do genoma inteiro, têm sido empregada para facilitar o caracterização de mutantes de exclusão em diversos organismos, incluindo animais e plantas20,21,22,23,24,25, 26,,27,28,29,30,31.
Para facilitar a caracterização de mutantes FNB em M. truncatula, uma todo-genoma baseada em array genômica hibridação comparativa (CGH) plataforma foi desenvolvida e validada. Conforme relatado em sistemas de animais, a plataforma CGH baseada em array permite a detecção de variações de número de cópia (CNVs) ao nível do genoma inteiro em mutantes M. truncatula FNB. Além disso, as lesões podem ser confirmadas por PCR e fronteiras de exclusão podem ser identificadas por sequenciamento. Em geral, a plataforma CGH matriz é uma ferramenta eficiente e eficaz na identificação de lesões em mutantes de M. truncatula FNB. Aqui, o procedimento CGH matriz e caracterização de PCR das fronteiras de exclusão em um mutante FNB M. truncatula são ilustrados.
O seguinte protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para os investigadores que estão interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro do número de cópia variações nas plantas. Como exemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante foi usado para identificar regiões de exclusão e associados com fenótipos mutantes de genes candidatos. M. truncatula FN6191 mutante, originalmente isolada de um neutrão rápido exclusão induzida por bombardeio mutante coleção32 (ver Tabela de materiais), exibiu um fenótipo de hipernodulação após a inoculação com o solo bactéria, tem Sihorhizobium Sm1021, em contraste com as plantas do tipo selvagem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4123A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago truncatula FN6191 (mutant)</td>
			<td>In house</td>
			<td>FN6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago truncatula Jemalong A17 (reference)</td>
			<td>In house</td>
			<td>A17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Plant Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureTag DNA Labeling Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>MJ research</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Labnet international Inc</td>
			<td>Spectrafuge 24D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilization and Drying Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Chamber gasket slides</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5188-5221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Chamber, stainless</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purification Columns</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-3391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanner</td>
			<td>Roche</td>
			<td>MS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NimbleScan 2.6</td>
			<td>Roche Nimblegen</td>
			<td>5225035001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal Map 1.9</td>
			<td>Roche Nimblegen</td>
			<td>Signalmap1.9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an array-based comparative genomic hybridization platform for efficient detection of copy number variations in fast neutron-induced medicago truncatula mutants

Os mutantes são inestimáveis recursos genéticos para estudos de função do gene. Para gerar conjuntos de mutante, três tipos de agentes mutagénicos podem ser utilizados, incluindo biológicos tais como o T-DNA ou transposon, produto químico como Metanossulfonato de etila (EMS), ou físico, como a radiação de ionização. O tipo de mutação observada varia de acordo com o mutagênico utilizado. Para ionização radiação induzida por mutantes, mutações incluem a exclusão, a duplicação ou rearranjo. Enquanto T-DNA ou mutagénese transposon-baseado é limitado a espécies que são suscetíveis a transformação, mutagênese química ou física pode ser aplicado a uma ampla gama de espécies. No entanto, a caracterização das mutações derivadas de mutagênese química ou física tradicionalmente baseia-se numa abordagem de clonagem baseados no mapa, que é a mão de obra intensiva e demorado. Aqui, nós mostramos que uma plataforma de hibridação genômica comparativa baseada em array (protocolo) do genoma de alta densidade pode ser aplicada para eficientemente detectar e caracterizar cópia números variações (CNVs) em mutantes derivados de mutagênese de bombardeio (FNB) de neutrões rápidos em Medicago truncatula, uma espécie de vegetal. Análise de sequências do genoma inteiro mostra que existem mais de 50.000 genes ou modelos de gene em M. truncatula. No presentes, induzida pelo FNB mutantes em M. truncatula são derivadas de mais de 150.000 linhas M1, representando inestimáveis recursos genéticos para estudos funcionais de genes no genoma. A plataforma de protocolo descrita aqui é uma ferramenta eficiente para caracterizar os mutantes FNB-induzida em M. truncatula.

A Figura 2 mostra a distribuição da proporção de2 registo normalizado do mutante contra WT sinais em todo o genoma inteiro. A análise dos dados CGH revelou uma aproximada 22 kb exclusão no cromossomo 4 que abrange o inteiro SUNN gene33 e diversas outras anotado genes em mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). A região de candidatos excluídos foi cobert...

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An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Este protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para pesquisadores interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro das variações números de cópia em plantas.

Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

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An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

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SCIENTISTS IN ACTION

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Genética

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

Aproveitando os Recursos CyVerse para<em&gt; De Novo</em&gt; Transcriptômica Comparativa de Organismos Não Servidos (não Modelos)

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...