Name: detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr
Uploaded: 2018-02-04T14:00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR at JoVE.com

लेखकों को प्राइमर डिजाइन, एशले McKibbon और जेसिका थॉमस के लिए कमि हैरिस-Ebbett फिल्माने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और जॉन ब्लेक, एलेक्जेंड्रा Foley-Eby, क्रिस लैंगली, जूली लुईस, Kelsey McIntyre, एशले McKibbon, क्रिस Zinck, और रोजी में दिखने के लिए कुत्ता वीडियो. ए. एम. के. ने कनाडाई लाइम रोग अनुसंधान फाउंडेशन का समर्थन किया था, और परियोजना के वित्तपोषण को प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा (NSERC) द्वारा प्रदान किया गया था । एम. के. बी. डब्ल्यू. ने न्यू ब्राउनश्विक इनोवेशन फाउंडेशन (NBIF) से वेतन अनुदान प्राप्त किया.

1. डीएनए से अलगाव ticks
<ol><li>क्षेत्र संग्रह, या पशु चिकित्सकों और जनता के सदस्यों से निष्क्रिय निगरानी के माध्यम से टिक प्राप्त करते हैं । ticks ठंड से मारे गए, एक सील बैग में रखा जाना चाहिए, और कमरे के तापमान पर भेज दिया ।<ol>
<li>एक सबमिशन प्रपत्र का उपयोग करना, मुठभेड़ की तारीख और भौगोलिक स्थिति पर जानकारी इकट्ठा, टिक लगाव की दशा, मेजबान प्रजातियों, और मेजबान के हाल ही में यात्रा के इतिहास ।</li>
		<li>के बाद से नेस्टेड पीसीआर स्वाभाविक संदूषण को कमजोर है, यह सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला कार्यक्षेत्र के नमूनों के पार जोखिम को कम करने के लिए स्थापित है । यह अलग, समर्पित रिक्त स्थान अच्छी तरह से एक दूसरे से अलग है कि अच्छी तरह से साफ कर रहे है और निष्फल, और सुनिश्चित करना है कि सभी उपकरणों के संदूषण से मुक्त है प्रोटोकॉल के विभिंन तत्वों को क्रियांवित करना शामिल है ।</li>
		<li>नमूना प्राप्त करने पर, फोटोग्राफ टिक और प्रजातियों का निर्धारण, विकासात्मक चरण, सेक्स, और एक पहचान कुंजी३२ की तुलना करके engorgement स्थिति ।</li>
		<li>रोकनेवाला शर्तों के तहत, bisect एक बाँझ उस्तरा ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग कर टिक, और अलग microcentrifuge ट्यूबों में दो टिक टुकड़े जगह है ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>कुल डीएनए निकालने के लिए, पीसीआर-संगत टेम्पलेट की पैदावार करने वाली किसी भी आइसोलेशन प्रक्रिया का उपयोग करें; यह प्रोटोकॉल एक साधारण केलेशनथेरेपी-आधारित दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है ।<ol>
<li>एक उचित मात्रा जोड़कर शुरू (अक्सर ५०-२०० µ एल के बीच) के एक lytic केलेशनथेरेपी रिएजेंट के लिए टिक टुकड़ा । विशिष्ट राशि नमूना आकार और engorgement स्थिति पर निर्भर करेगा; दिशानिर्देश निर्माता द्वारा प्रदान किया जाना चाहिए । एक microtube खल का प्रयोग Homogenize ।</li>
		<li>४५ मिनट के लिए ६० ° c में एक पानी स्नान में नमूनों की मशीन, और संक्षेप में भंवर ।</li>
		<li>एक डेस्कटॉप microcentrifuge में १६,२७६ x g (१३,३०० rpm) पर 4 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक ।</li>
		<li>स्थानांतरण supernatant के लिए एक ताजा, microtube लेबल युक्त ५० µ l isopropanol, उलटा द्वारा मिश्रण, और पुनः के रूप में (1.2.3) में केंद्रापसारक ।</li>
		<li>supernatant खिचड़ी भाषा, और कुल्ला ७०% इथेनॉल के ५० µ एल के साथ डीएनए गोली ।</li>
		<li>एक पिपेट के साथ अतिरिक्त इथेनॉल निकालें, और हवा के लिए गोली की अनुमति-कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सूखी ।</li>
		<li>डीएनए reसस्पेंड करने के लिए, 1 मिमी Tris पीएच ७.० के ५० µ एल जोड़ने के लिए, और एक पानी स्नान में 1 एच के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर नमूने की मशीन । डीएनए अब भविष्य आणविक विश्लेषण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. अरै OspA और FlaBके नेस्टेड पीसीआर का पता लगाने ।
नोट: सामान्य पीसीआर सिद्धांतों और पद्धतियों का अवलोकन Lorenz, २०१२३३द्वारा प्रदान किया गया है ।
<ol><li>संश्लेषित या अरै जीन विशिष्ट बाहरी और भीतरी oligonucleotide प्राइमरों प्राप्त करते हैं । प्राइमर सेट, उनके संबंधित amplicon आकार, और पिघलने तापमान के लिए तालिका 1 देखें ।</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>प्राइमरी का नाम</td>
			<td>जीन लक्ष्य</td>
			<td colspan="2">अनुक्रम (5 '-3 ')</td>
			<td>Amplicon आकार</td>
			<td>एनीलिंग तापमान</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB आउट अग्रेषित करना</td>
			<td>flab</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">५०३ बीपी</td>
			<td rowspan="2">55 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>FlaB आउट Rv</td>
			<td>flab</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>परिवार कल्याण में FlaB</td>
			<td>flab</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">४४७ बीपी</td>
			<td rowspan="2">58 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv में FlaB</td>
			<td>flab</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA आउट अग्रेषित करना</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">४८७ बीपी</td>
			<td rowspan="2">55 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA आउट Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>परिवार कल्याण में OspA</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">३५० बीपी</td>
			<td rowspan="2">58 ° c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv में OspA</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: अरै burgdorferiFlaB और OspA के nPCR के लिए भीतरी और बाहरी प्राइमर । अभ्यास में, FlaB प्राइमरों का पता लगाने बी burgdorferi एस और अंय बारीकी से संबंधित अरै genospecies, जबकि OspA प्राइमरों पर कब्जा केवल burgdorferi एस प्रवर्धन से दोनों loci का संकेत होगा बी । burgdorferi । एस
<ol start="2"><li>पूर्व यूवी प्रकाश और ७०% इथेनॉल के साथ एक पीसीआर कैबिनेट बंध्याकरण । नोट: संभावित नमूना संदूषण को कम करने के लिए, इस कार्यस्थान को टिक विच्छेदन, डीएनए निष्कर्षण, और जेल ट्रो के स्थान से अलग होना चाहिए ।<ol>
<li>प्रारंभिक पीसीआर चलाने के लिए, ऊपर चरण १.० में बरामद डीएनए टेंपलेट के साथ संयोजन के रूप में बाहरी प्राइमरों का उपयोग करें, और प्रतिक्रिया मिश्रण सेट के रूप में तालिका 2में वर्णित । समानांतर में, सकारात्मक नियंत्रण प्रदर्शन सत्यापित अरै डीएनए से मिलकर चलाता है, और नकारात्मक नियंत्रण नहीं-reएजेंट और एयरोसोल संदूषण का पता लगाने के लिए प्रतिक्रियाओं सहित चलाता है । अंत में डीएनए जोड़ें रिएजेंट के संभावित संदूषण को कम करने के लिए । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब हर समय बंद कर दिया है, जब एजेंट नहीं जोड़ा जा रहा है और बंद ट्यूब तुरंत डीएनए के अलावा और इससे पहले अंय ट्यूबों खोल रहे हैं ।</li>
		<li>कार्यक्रम एक थर्मल साइकिल चालक निंनानुसार: ९५ ° c 5 मिनट के लिए; ४० के लिए ९५ ° c के चक्र 15 s, एनीलिंग तापमान के लिए 30 s, ७२ ° c के लिए ४५ s; 5 मिनट के लिए ७२ ° c; और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>पहली प्रतिक्रिया के समान पीसीआर के दूसरे दौर प्रदर्शन, पहले पीसीआर उत्पाद के 2 µ एल के साथ इनर प्राइमरों का उपयोग करें ( -8 में उत्पादित) को छोड़कर । नोट: प्रतिक्रिया खंड फिर से तालिका 2में प्रदान किए जाते हैं । देखभाल के पार से बचने के लिए लिया जाना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने के टेंपलेट डीएनए और पिछले जोड़ा है कि केवल एक नमूना करने के लिए इसी ट्यूबों एक समय में खुले है द्वारा amplicons के संदूषण । 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>घटक</td>
				<td>पीसीआर # 1 खंड</td>
				<td>पीसीआर # 2 खंड</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण 2x</td>
				<td>१२.५ µ l</td>
				<td>१२.५ µ l</td>
			</tr>
<tr>
<td>Nuclease-मुफ्त पानी</td>
				<td>८.५ µ l</td>
				<td>८.५ µ l</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µ एम फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर</td>
				<td>१.० µ एल आउटर प्राइमरी</td>
				<td>१.० µ एल इनर प्राइमर</td>
			</tr>
<tr>
<td>डीएनए टेम्पलेट</td>
				<td>२.० µ एल, नमूना निष्कर्षण (1.2.7) से</td>
				<td>२.० µ एल, पीसीआर के राउंड 1 से ( -8)</td>
			</tr>
</tbody></table>
तालिका 2: पहली और दूसरी प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण । 
	 
	<ol>
<li>कार्यक्रम से पहले के रूप में थर्मल साइकिल चालक, लेकिन एनीलिंग तापमान को समायोजित करने के लिए इनर प्राइमरों को समायोजित (1 तालिका को देखें) ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agarose जेल ट्रो और इमेजिंग
नोट: ट्रो द्वारा डीएनए को अलग करने पर बुनियादी निर्देशों के लिए, देख ली एट अल, २०१२३४।
<ol><li>एक १.२% agarose 20X SB बफर (०.२ एम NaOH, ०.८ m बोरिक एसिड पीएच 8) का उपयोग कर जेल तैयार, 1x पतला, और एक डीएनए दाग के लगभग 5 µ एल जोड़ने के लिए, डालने से पहले, अगर पूर्व जेल के धुंधलाना वांछित है ।</li>
	<li>एक १०० बीपी सीढ़ी (5 µ एल) के साथ दूसरा (इनर) प्रत्येक प्रयोगात्मक और नियंत्रण नमूना से पीसीआर प्रतिक्रिया से उत्पाद के 10 µ एल लोड ।<ol>
<li>Electrophorese के लिए 1 घंटे में १०७ V (5v/</li>
	</ol>
</li>
	<li>देखें और एक transilluminator और संबंधित कैमरा और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जेल दस्तावेज़ ।</li>
</ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

लाइम रोग (एलडी) उत्तरी गोलार्द्ध में सबसे अधिक प्रचलित वेक्टर जनित संक्रमण है, और इसकी घटनाओं में1वृद्धि जारी है । यह दुर्बल बीमारी लाइम लाइम (पौंड) परिसर के spirocheteal रोगजनकों के कारण होता है (सामांयतः अरै burgdorferi कामुक लाटो, या s.l. के रूप में जाना जाता है), जो ऐतिहासिक रूप से प्रमुख उत्तर अमेरिकी रोगज़नक़, बी शामिल है burgdorferi कामुक stricto (एस. एस.), बी afzelii और बी garinii, जो यूरोप और एशिया भर में बड़े पैमाने पर कर रहे है के अलावा, और उभरते नैदानिक प्रासंगिकता2,3की प्रजातियों हैं । ये जीवाणु संक्रमित Ixodes ticks2के काटने के माध्यम से मनुष्यों को प्रेषित कर रहे हैं। हालांकि मुख्य उत्तर अमेरिकी वैक्टर scapularis और pacificusहैं, इस जीनस के भीतर कई प्रजातियों बंदरगाह के लिए पाया गया है और जीवाणु4संचारित । मनुष्यों में, बी burgdorferi त्वचा, जोड़ों, दिल, तंत्रिका तंत्र, अंत में ग्रंथि, जठरांत्र संबंधी मार्ग, और आंतरिक अंगों5,6,7को प्रभावित करने के लक्षण पैदा कर सकता है, 8,9,10. रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र वर्तमान में संयुक्त राज्य अमेरिका11,12में सालाना ३००,००० नए मानव मामलों पर अनुमान है । जबकि रोग का निदान अक्सर अनुकूल है जब बीमारी का पता चला है और प्रारंभिक अवस्था में इलाज किया है, अध्ययनों से सुझाव दिया है कि कहीं भी 10% और रोगियों की सिफारिश की एंटीबायोटिक आहार प्राप्त की ६०% के बीच चिकित्सा के बाद लक्षण अनुभव करने के लिए जारी प्रेक्टिस, एक घटना में पद उपचार लाइम रोग सिंड्रोम (PTLDS)13,14,15। इसके अलावा, नैदानिक हस्तक्षेप में देरी एक टिक काटने के बारे में जागरूकता की कमी का एक परिणाम के रूप में पैदा कर सकते हैं, प्रारंभिक बीमारी के गैर विशिष्ट प्रस्तुति, और संक्रमण की शुरुआत में इस्तेमाल किया जब पारंपरिक सीरोलॉजी-आधारित निदान की कम संवेदनशीलता. तेजी से इलाज के लिए विफलता और उचित लक्षण प्रगति है कि तेजी से दुर्बलता में प्रकट कर सकते हैं सक्षम बनाता है16,17जटिलताओं । लाइम रोग निवारण इसलिए जोखिम प्रबंधन की आधारशिला है । इस बढ़ते खतरे से निपटने के लिए रणनीतियों में टिकर में रोगजनक प्रसार को इंगित करने के लिए मजबूत निगरानी उपाय शामिल हैं, और चिंता के भौगोलिक क्षेत्रों की पहचान करें ।
यह आलेख नेस्टेड पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (nPCR) की उपयोगिता को एक आणविक स्क्रीनिंग टूल के रूप में प्रदर्शित करता है जिसके द्वारा संक्रमित टिकरों की पहचान की जाती है. विशिष्टता बढ़ाने के लिए, समानांतर प्रवर्धन के लिए दो अरै जीन का उपयोग किया जाता है । Flagellin बी (FlaB) encodes flagellum के एक प्रमुख रेशा प्रोटीन18, और जीन एकल रैखिक गुणसूत्र पर स्थित है, जबकि बाहरी सतह प्रोटीन एक (OspA) मध्यस्थता टिक midgut के लिपोप्रोटीन उत्पाद औपनिवेशीकरण, और है प्लाज्मिड-इनकोडिंग19,20। कार्यप्रवाह टिक संग्रह, डीएनए निष्कर्षण, और फिर अरै-विशिष्ट loci का पता लगाने के लिए पीसीआर के एक प्रारंभिक दौर के होते हैं । बाद में पीसीआर एक नए के रूप में पहली प्रतिक्रिया के उत्पाद का उपयोग करता है छोटे, आंतरिक प्रवर्धन टुकड़े उत्पंन खाके । एक टिक अरै burgdorferi के लिए सकारात्मक माना जाता है जब दोनों अरै जीन से भीतरी amplicons agarose जेल ट्रो द्वारा पता लगाया जा सकता है ।
दोनों nPCR तकनीक, और FlaB और OspA जीन लक्ष्य, व्यापक रूप से 1990 के दशक21के बाद से पारिस्थितिकी निगरानी और लाइम spirochete के नैदानिक जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है,22,23 ,24,25. आणविक प्रोटोकॉल के विकास से पहले, ticks विरोधी को आंत सामग्री-अरै इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) धुंधला, माइक्रोबियल संस्कृति, या तत्संबंधी संयोजन26के अधीन द्वारा मूल्यांकन किया गया । इन तरीकों अंतर्निहित सीमाओं से ग्रस्त हैं, अरै27की धीमी वृद्धि और दुराराध्य प्रकृति सहित, एंटीबॉडी प्रदर्शन के मुद्दों, और यदि प्रसंस्करण21के लिए जीना ticks की आवश्यकता । बाद में संक्रमित वैक्टर की तीव्र, संवेदनशील और विशिष्ट पहचान प्रदान करने के लिए पीसीआर को अपनाया गया । यह पारंपरिक पद्धति, संस्कृति सहित विविध प्रकार के नमूने के लिए स्वतंत्र प्रत्यक्ष आवेदन, जैसे मृत और संग्रहीत ticks है कि अंयथा21,22 के परीक्षण के लिए अनुपयुक्त होगा के रूप में चिह्नित सुधार की पेशकश की . नेस्टेड प्रयोगात्मक डिजाइन आगे25,28प्रवर्धन के दो लगातार दौर में जीन विशिष्ट प्राइमरों के दो अलग सेट को रोजगार से विशिष्टता और शास्त्रीय पीसीआर की संवेदनशीलता पर सुधार ।
प्रायोगिक सफलता सामरिक जीन चयन और amplicon डिजाइन पर गंभीर रूप से निर्भर है । सही अरै burgdorferiकी उपस्थिति का अनुमान लगाने के लिए, प्राइमरों को भी अरै जीनस में spirochetes के साथ परस्पर प्रतिक्रिया के बिना प्रासंगिक रोगजनकों का पता लगाना चाहिए । FlaBके मामले में, इस विशिष्टता जीन के एक चर आंतरिक क्षेत्र को लक्षित करने के बजाय अपेक्षाकृत संरक्षित है कि विविध जीवाणुओं द्वारा साझा कर रहे है क्रम से हासिल की है (चित्रा 1)24,29 , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> चित्रा 1: nPCR की अवधारणा, के रूप में सचित्र प्रयोग अरै FlaB जीन एक लक्ष्य के रूप में । जीन के 5 ' और 3 ' टर्मिनी अरै burgdorferi s.l. से परे जीवों के लिए आम हैं, लाइम के विशिष्ट आकलन के लिए इन क्षेत्रों अनुपयुक्त प्रतिपादन रोगजनकों के कारण । प्राइमरी लक्ष्य के रूप में कम संरक्षित इंटीरियर दृश्यों का उपयोग करना, पीसीआर के दो राउंड एक अंतिम, आंतरिक amplicon का पता लगाने के लिए निष्पादित कर रहे हैं । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
उनकी भेदभावपूर्ण क्षमता के परीक्षण में, इंटीरियर FlaB प्राइमरों से अधिक ८० अलग अरै पृथक के साथ मूल्यांकन किया गया है, और केवल लाइम रोग24के साथ जुड़े लोगों की पहचान करने के लिए पाया । nPCR के कम पता लगाने की सीमा के बीच में प्रलेखित किया गया है छह24 और दस शुद्ध संस्कृति से31 बैक्टीरिया, हालांकि संवेदनशीलता आगे दक्षिणी सोख्ता amplicon द्वारा सुधार किया जा सकता है, और hybridizing एक radiolabelled या chemiluminescent जांच की । युग्मन तकनीक एक एकल spirochete31के लिए खोज थ्रेशोल्ड कम कर देता है । प्रत्यक्ष तुलना, पारंपरिक, जांच एकल दौर पीसीआर द्वारा 104 spirochetes31की एक ंयूनतम की उपस्थिति की रिपोर्ट पाया गया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि परख संवेदनशीलता कम हो जाएगा जब जटिल पर्यावरण और नैदानिक नमूनों के साथ काम, असंबंधित डीएनए और संभावित निरोधात्मक पदार्थों की भारी उपस्थिति के कारण । इन चुनौतियों को काफी हद तक nPCR के इस्तेमाल से दरकिनार किया जा सकता है.
पिछले दशकों में आणविक प्रौद्योगिकियों में अग्रिमों के बावजूद, nPCR आधुनिक निगरानी प्रयासों में एक प्रधान तकनीक बनी हुई है. यदि देखभाल डिजाइन और इस प्रोटोकॉल के निष्पादन में लिया जाता है, यह एक शक्तिशाली, अनुकूलनीय, और अपेक्षाकृत सीधा करने के लिए tick वैक्टर में रोगजनकों की उपस्थिति पर कब्जा दृष्टिकोण है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="830">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Nuaire</td>
			<td style="width:140px;">ES AIR NU-543&#160;</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Razor blades</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">55411-050</td>
			<td>0.22 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL)</td>
			<td style="width:192px;">Axygen</td>
			<td style="width:140px;">311-08-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">AquaGenomic&#160;</td>
			<td style="width:192px;">MultiTarget Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:140px;">2030</td>
			<td>DNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microtube Pestle</td>
			<td style="width:192px;">Diamed</td>
			<td style="width:140px;">DIATEC610-1551</td>
			<td>Designed for 1.5 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Water bath - Isotemp 202</td>
			<td style="width:192px;">Fishse Scientific</td>
			<td style="width:140px;">15-462-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">S0100 CAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C2400</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">BIS-TRIS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Primer Synthesis</td>
			<td style="width:192px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">OLIGO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR Cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Misonix</td>
			<td style="width:140px;">PCR6-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PCR tube with attached flat caps 0.2mL</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">20170-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GoTaq Green Master Mix 2x</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:192px;">Promega</td>
			<td style="width:140px;">M7123</td>
			<td>The water comes with the GTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spectrafuge Mini</td>
			<td style="width:192px;">Labnet</td>
			<td style="width:140px;">C1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td>
			<td style="width:192px;">EDVOTEK</td>
			<td style="width:140px;">608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">A87-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">GD 100 bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:192px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:140px;">DM001-R500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Electrophoresis power pack&#160;</td>
			<td style="width:192px;">VWR</td>
			<td style="width:140px;">VWR 105</td>
			<td>EC Apparatus Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Fluor-S MultiImager&#160;</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">170-7700 (Serial number 433B0154)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:299px;">Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2)</td>
			<td style="width:192px;">BioRad</td>
			<td style="width:140px;">1709600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the lyme disease spirochete, borrelia burgdorferi, in ticks using nested pcr

लाइम रोग एक गंभीर वेक्टर जनित संक्रमण है जो कि spirochetes के अरै burgdorferi कामुक लाटो परिवार के कारण होता है, जो संक्रमित Ixodes ticks के काटने के माध्यम से मनुष्यों को फैलता है । उत्तरी अमेरिका में प्राथमिक etiological एजेंट अरै burgdorferi कामुक stricto है । के रूप में भौगोलिक जोखिम क्षेत्रों का विस्तार, यह मजबूत निगरानी प्रोग्राम है कि टिक संक्रमण दर उपाय कर सकते है समर्थन विवेकपूर्ण है, और चिकित्सकों, पशु चिकित्सकों, और आम जनता के लिए निष्कर्षों संवाद । नेस्टेड पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (nPCR) की आणविक तकनीक लंबे समय से इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह एक केंद्रीय, सस्ता, और मजबूत दृष्टिकोण अरै दोनों ticks और वंय जीवन में का पता लगाने में रहता है ।
यह लेख nPCR के आवेदन को दर्शाता है डीएनए निष्कर्षों को टिक करने के लिए संक्रमित नमूनों की पहचान । दो स्वतंत्र बी burgdorferi लक्ष्य, जीन एंकोडिंग Flagellin बी (FlaB) और बाहरी सतह प्रोटीन एक (OspA), इस तकनीक के साथ बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है । प्रोटोकॉल टिक संग्रह, डीएनए निष्कर्षण शामिल है, और फिर पीसीआर के एक प्रारंभिक दौर में प्रत्येक दो अरै-विशिष्ट loci का पता लगाने के लिए । बाद में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक नए के रूप में पहली प्रतिक्रिया के उत्पाद का उपयोग करता है छोटे, आंतरिक प्रवर्धन टुकड़े उत्पंन खाके । नेस्टेड दृष्टिकोण दोनों विशिष्टता और पारंपरिक पीसीआर की संवेदनशीलता पर सुधार । एक टिक रोगज़नक़ के लिए सकारात्मक माना जाता है जब दोनों अरै जीन से भीतरी amplicons agarose जेल ट्रो द्वारा पता लगाया जा सकता है ।

nPCR विशिष्ट और रोगज़नक़ का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए एक सुरुचिपूर्ण दृष्टिकोण है, विशेष रूप से जब जटिल पर्यावरणीय नमूने जांच के अधीन हैं । जैसा कि चित्रा 1में दर्शाया गया है, पीसीआर के दो दौर अरै FlaB लोकस (और OspA, चित्र नहीं) के एक रणनीतिक क्षेत्र को लक्षित करने के लघु भीतरी पीढ़ी के माध्यम से अरै burgdorferi बैक्टीरिया की उपस्थिति की रिपोर्ट कर सकते है amplicons । जब जेल ट्रो द्वारा हल, प्रत्येक टिक से FlaB और OspA प्रतिक्रिया उत्पादों नेत्रहीन रन बनाए और नियंत्रण के खिलाफ तुलना कर सकते हैं । चित्रा 2में, अद्वितीय नमूना पहचानकर्ता प्रत्येक जेल के शीर्ष के साथ प्रदान की जाती हैं, और कोई टेम्पलेट और एयरोसोल नियंत्रण दूर छोड़ दिया और सही में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, क्रमशः, सीढ़ी से सटे.
मजबूत amplicon बैंड का चयन प्रयोगात्मक नमूनों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, और वे आसानी से अधिशेष प्राइमरों और अवशिष्ट डीएनए से प्रतिष्ठित है (चित्रा 2) । प्रयोगात्मक डिजाइन सिद्धांतों आगे सेट के आधार पर, एक टिक अरै जब समानांतर नकारात्मक नियंत्रण नहीं प्रवर्धन प्रदर्शन के लिए सकारात्मक माना जाता है, और भीतरी amplicons दोनों FlaB और OspA प्राइमरों से उत्पादित कर रहे हैं । इस मामले में, नमूनों T907, T604, और T606 लाइम रोगज़नक़ (चित्रा 2) के लिए निगरानी मानदंडों से मुलाकात की । इसके विपरीत, T923 केवल OspAके लिए सकारात्मक था, एक परिणाम है जिसके लिए कई संभव स्पष्टीकरण कर रहे हैं: एक) मूल के टिक अरैके लिए नकारात्मक था, लेकिन बाहरी या भीतरी OspA पीसीआर की तैयारी के साथ प्रदूषित spuriously था टेंपलेट डीएनए (ध्यान दें कि पुनर्अभिकर्ताओं के प्रणालीगत संदूषण नकारात्मक नियंत्रण के माध्यम से शासन किया गया था), ख) टिक लाइम अरै, लेकिन कम टेंपलेट राशि या प्रयोगात्मक त्रुटि FlaBके प्रवर्धन रोका, या ग) एक जीव मौजूद था कि संरक्षित OspA अनुक्रम निहित है, लेकिन अभाव Flagellin या FlaB के लक्षित क्षेत्र में अपर्याप्त पहचान के लिए प्राइमरों को एनएन था । दरअसल, OspA अनुक्रम समानताएं पौधों और जानवरों28सहित जीवों की एक किस्म में उल्लेख किया गया है । बातचीत की स्थिति, अधिक संरक्षित Flagellin जीन के प्रवर्धन, लेकिन नहीं OspA जीन, एक संबंधित अरै प्रजातियों का संकेत सकता है । व्यवहार में, इस प्रोटोकॉल की पैदावार अधिक OspA एकल सकारात्मक परिणाम से FlaB प्राइमर, सुझाव है कि ' एक ' परिदृश्य है ंयूनतम विवरण की संभावना है । विवादास्पद नमूना के आगे प्रयोगात्मक विश्लेषण के बिना, तथापि, यह एक सकारात्मक परिणाम के स्रोत का निर्धारण करने के लिए संभव नहीं है । तकनीकी प्रतिकृति गोलमोल नमूनों पर प्रदर्शन की संख्या में वृद्धि उनकी सही स्थिति सामंजस्य करने में मदद कर सकते हैं, के बाद से किसी भी दूषित spuriously पिछले प्रतिक्रियाओं के लिए प्रस्तुत किए गए थे संग्रहीत डीएनए में मौजूद नहीं होगा । हालांकि, अगर इन प्राइमरों के साथ बाद प्रतिक्रियाओं निर्णायक परिणाम प्रदान करने में विफल, अंय अरै loci पीसीआर द्वारा जांच की जा सकती है । Amplicons इन प्रतिक्रियाओं से उत्पन्न भी अनुक्रम किया जा सकता है और पहचान को असाइन करने में मदद करने के लिए अलग के बीच तुलना, और तनाव विचलन की डिग्री का अनुमान. सापि और सहकर्मी मानव नैदानिक नमूनों३५का उपयोग कर इस वर्कफ़्लो का एक उदाहरण प्रदान करते हैं ।
सभी कारकों पर विचार किया, रेखांकित प्रोटोकॉल और व्याख्या मानदंड को ०.१७% और ०.००६३% की झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक दरों, क्रमशः उपज का अनुमान लगाया गया है ।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> चित्र 2 : का पता लगाना अरै burgdorferi के nPCR द्वारा व्यक्तिगत ticks में FlaB और OspA । प्रत्येक टिक को असाइन किए गए कोड जैल के शीर्ष पर प्रस्तुत किए जाते हैं, और पहचान प्रत्येक नमूने में OspA और FlaB का पता लगाने के लिए अनुलंब रूप से संरेखित होती है । छवि के बाईं ओर में बी हकदार गलियों नहीं, नियंत्रण टेंपलेट का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि एक (दाहिने हाथ लेन) एयरोसोल को प्रयोगशाला पर्यावरण के संदूषण पर कब्जा नियंत्रण कर रहे हैं । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

नेस्टेड पीसीआर एक संवेदनशील, विशिष्ट, और सरल तकनीक है कि डीएनए निष्कर्षों को टिक अरै burgdorferi, लाइम रोग के प्रेरणा का एजेंट के लिए जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है । प्रारंभिक पीसीआर प्रयोग जीन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करता है के लिए लंबे amplicons है, जो फिर एक बाद प्रतिक्रिया के लिए टेंपलेट्स बन उत्पंन आंतरिक प्राइमरों का उपयोग ।

लाइम रोग Spirochete, अरै Burgdorferiका पता लगाने में, नेस्टेड पीसीआर का उपयोग टिक में

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

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