Name: deep proteome profiling by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, mass spectrometry, and software-assisted quantification
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification at JoVE.com

Los autores agradecen a todos los demás miembros laboratorio y centro de debate útil. Este trabajo fue parcialmente apoyado por H NI otorga ALSAC, R01GM114260, R01AG047928 y R01AG053987. Se realizó el análisis de MS en de St. Jude Children Research Hospital proteómica, parcialmente financiado por subvenciones de NIH centro apoyo P30CA021765. Los autores agradecen a Nisha Badders ayuda con editar el manuscrito.

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de seguridad (es decir, MSDS) antes de uso. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza este protocolo de.
 Nota: se utiliza un conjunto de reactivos TMT 10-plex etiqueta isobárico en este protocolo para la cuantificación de proteoma de 10 muestras.
 1. preparación de células/tejidos Nota: es fundamental recoger las muestras en un tiempo mínimo a baja temperatu...

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	<li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry.">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li><li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+proteomics:+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics.">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li><li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics.">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function.">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling.">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses.">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li><li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays:+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run.">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer's+disease.">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases.">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li><li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia.">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk.">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464 (2016).</li><li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth.">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines.">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides.">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome.">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li><li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+one+hour+yeast+proteome.">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JUMP:+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy.">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li><li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics.">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li><li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry.">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li><li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics.">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers.">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li><li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+purification+enables+accurate,+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging.">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiNotch+MS3+enables+accurate,+sensitive,+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes.">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry.">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers.">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li><li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments.">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li><li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics.">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li><li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation.">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li><li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells.">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li><li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome.">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JUMPg:+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells.">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types.">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li><li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteogenomics:+concepts,+applications+and+computational+strategies.">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li><li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics.">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li></ol>

Se describe un protocolo de alto rendimiento para la cuantificación de proteínas con una estrategia etiquetado isobárico 10-plex, que se ha aplicado con éxito en varias publicaciones12,13,14,32 . En este protocolo, podemos analizar hasta 10 muestras diferentes de proteínas biológicas en el 1 experimento. Habitualmente podemos identificar y cuantificar proteínas más 10.000 con alta confi...

Avances en la tecnología de secuenciación de última generación han llevado a un nuevo panorama para el estudio de sistemas biológicos y enfermedad humana. Esto ha permitido un gran número de mediciones de genoma, transcriptoma, proteoma, metaboloma y otros sistemas moleculares a ser tangible. Espectrometría de masas (MS) es uno de los más sensibles métodos de química analítica y su aplicación en proteómica ha ampliado rápidamente después de la secuenciación del genoma humano. En el campo de la proteómica, los últimos años han producido importantes avances en los análisis cuantitativos basados en MS, incluyendo etiquetado isobárico y la multiplexación capacidad combinada con cromatografía líquida extensa, además de instrumentación avanza, lo que permite mediciones más rápidas, más precisas con menos material de muestra requerido. Proteómica cuantitativa se ha convertido en un enfoque convencional para perfiles de decenas de miles de proteínas y modificaciones postraduccionales en muestras biológicas altamente complejas1,2,3,4 , 5 , 6.
Multiplexados métodos Etiquetadoras isobáricos isobáricos etiqueta para cuantificación absoluta y relativa (es decir, iTRAQ) y etiqueta de masa tándem (TMT) MS grandemente mejorado rendimiento de muestra y aumentó el número de muestras que pueden analizarse en un solo experimento1,6,7,8. Junto con otros métodos de cuantificación basado en MS, cuantificación de etiqueta-libre como el isótopo estable que etiqueta con aminoácidos en cultura de célula (es decir, SILAC), el potencial de estas técnicas en la proteómica campo es considerable9 ,10,11. Por ejemplo, el método TMT permite 10 muestras de proteínas a analizar juntos en 1 experimento utilizando reactivos 10-plex. Estas etiquetas TMT estructuralmente idénticas tienen la misma masa global, pero los isótopos pesados se distribuyen diferencialmente en átomos de carbono o nitrógeno, resultando en un ión único reportero durante fragmentación de MS/MS de cada etiqueta, permitiendo la cuantificación relativa entre las 10 muestras. La estrategia TMT se aplica rutinariamente para estudiar vías biológicas, progresión de la enfermedad y los procesos celulares12,13,14.
Sustanciales mejoras técnicas han mejorado los sistemas de cromatografía líquida (LC)-MS/MS, tanto en términos de parámetros de MS, para maximizar la identificación de proteínas sin sacrificar la precisión de la cuantificación y separaciones LC. Primera dimensión separación de péptidos mediante una técnica de separación con alta ortogonalidad a la segunda dimensión es fundamental en este tipo de método de Proteómica de escopeta para lograr máximos resultados20. Cromatografía líquida de fase inversa de alto pH (RPLC) proporciona un mejor rendimiento que hace de la cromatografía de intercambio catiónico fuerte convencional20. Cuando RPLC de alto pH se combina con una segunda dimensión de TAGATOSA bajo pH, rango dinámico análisis y cobertura de proteína se mejoran, dando por resultado la capacidad para identificar la mayor parte de las proteínas expresadas al realizar análisis de proteoma conjunto15 ,16,17,18. Otros avances incluyen pequeñas partículas de C18 (1,9 μm) y extendido largo columna (~ 1 m)19. Además, otras mejoras notables incluyen nuevas versiones de espectrómetros de masas con las tasas de exploración rápida, mejoras en la sensibilidad y resolución20y sofisticada bioinformática tuberías para MS datos minería21.
Aquí, describimos un protocolo detallado que incorpora las más recientes metodologías con modificaciones para mejorar la sensibilidad y rendimiento, mientras se centra en los mecanismos de control de calidad durante todo el experimento. El protocolo incluye la extracción de proteínas y la digestión, TMT 10-plex etiquetado, pH básico y pH ácido RPLC fraccionamiento, detección MS alta resolución y procesamiento de datos de MS (figura 1). Además, implementamos varios pasos de control de calidad para solucionar problemas y evaluar la variación experimental. Este protocolo detallado está destinada a nuevos investigadores en el campo habitualmente identificar y cuantificar con precisión miles de proteínas a partir de un lisado o tejido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1220 LC system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4288B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Hydroxylamine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Burdick &#38; Jackson</td>
			<td>AH015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly Portfolio Heater</td>
			<td>Phoenix S&#38;T</td>
			<td>PST-BPH-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 tips</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-4607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>41648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FC203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>GB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Burdick &#38; Jackson</td>
			<td>AH230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Q Exactive HF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoflow UPLC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Ultimate 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH</td>
			<td>r119.aq.0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self Pck Columns</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>PF360-75-15-N-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedva</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD11V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMT 10plex Isobaric label reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>400003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V511C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xbridge Column C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziptips C18</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SepPak 1cc 50mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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deep proteome profiling by isobaric labeling, extensive liquid chromatography, mass spectrometry, and software-assisted quantification

Se han logrado muchos avances excepcionales en espectrometría de masas (MS)-basado en proteómica, con progreso técnico especial en cromatografía líquida (LC) acoplada a la espectrometría total en tándem (LC-MS/MS) y la capacidad de multiplexación etiquetado isobárico. Aquí, presentamos un protocolo perfilado profundo-proteómica que combina 10-plex etiqueta masa tándem (TMT) etiquetado con una amplia plataforma LC/LC-MS/MS y corrección de interferencias computacional MS post para cuantificar con precisión todo proteomas. Este protocolo incluye los siguientes pasos principales: extracción de proteínas y la digestión, etiquetado TMT, 2 dimensiones (2D) LC, espectrometría de masas de alta resolución y procesamiento computacional de datos. Medidas de control de calidad se incluyen para solucionar problemas y evaluar la variación experimental. Más de 10.000 proteínas en muestras de mamíferas pueden cuantificarse con confianza con este protocolo. Este protocolo se puede aplicar también a la cuantificación de modificación post traduccional con cambios menores. Este método multiplexado, robusto proporciona una poderosa herramienta para análisis proteómico en una variedad de muestras complejas, incluyendo cultivo de células, tejidos animales y especímenes clínicos humanos.

Utilizamos una mezcla de péptidos especie descrita para analizar sistemáticamente el efecto de la compresión de la relación en 3 pasos principales del Protocolo, incluyendo fraccionamiento pre-MS, MS ajustes y corrección de post-MS23. El fraccionamiento de pre-MS fue evaluado y optimizado mediante el uso de una combinación de pH básico TAGATOSA y pH ácido RPLC. Para el análisis de post-MS, se consideraron sólo los péptidos específicos. Utilizamos este m...

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Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Investigación

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...