Name: sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-04T13:00:00
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Diese Forschung wurde unterstützt durch die Bio &#38; Medical Technology Development Program des National Research Foundation (NRF) &#38; von der koreanischen Regierung finanziert (MSIP &#38; MOHW) (Nr. 2016M3A9B6904244). Wir danken auch Mitglieder des Medicinal-Bioconvergence-Forschungszentrum für die Reinigung der Exosom.

1. Block Vorbereitung, schneiden, färben und Imaging-von die Exosom
<ol>
	<li>Pellet-Exosomen von Kultur überstand HCT116 Zellen durch Zentrifugation bei 100.000 x g für 1,5 h23. Entfernen Sie die Kultur überstand und beheben sorgfältig gereinigten Exosom Pellet mit 1 mL 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M-Natrium-Cacodylate-Lösung (pH 7,0) für 1 h bei 4 ° c zu Lösen Sie für 0,1 M Natrium Cacodylate 4,28 g cacodylic Säure in 160 mL destilliertem Wasser (DW auf). Stellen Sie pH auf 7,4 mit 0,...

<ol>
	<li>Friend, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+cell+lines+derived+from+a+patient+with+Hodgkin's+disease.">Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease.</a> Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).</li><li>Dvorak, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+shedding+and+coagulation.">Tumor shedding and coagulation.</a> Science. 212 (4497), 923-924 (1981).</li><li>Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+controls+the+secretion+of+inflammatory+lysyl-tRNA+synthetase+in+exosomes+from+cancer+cells.">Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).</li><li>Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+biologic+characterization+of+exosomes+and+microvesicles+as+facilitators+of+HIV-1+infection+in+macrophages.">Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages.</a> J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).</li><li>Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+mediate+cell+contact-independent+ephrin-Eph+signaling+during+axon+guidance.">Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance.</a> J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>van Niel, G., Heyman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+cytoskeleton+and+intracellular+trafficking.+II.+Intestinal+epithelial+cell+exosomes:+perspectives+on+their+structure+and+function.">The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).</li></ol>

Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Beobachtung der detaillierten Exosom Struktur und Kennzeichnung von seiner spezifischen Proteine. Negative Färbung galt als die beste Methode für Exosom imaging-17. Diese konventionelle Technik hat Exosomen becherförmigen Struktur gezeigt. Diese Becherform ist jedoch eine Form von Artefakt, das durch die Trocknung entstehen kann. Cryo-TEM Ergebnisse haben gezeigt, dass Exosomen eine perfekt kugelförmige Struktur in wässriger Lösung25<...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Lipid Bilayer Vesikel durch Zellen abgesondert, und ihre Größe schwankt zwischen 30 und 300 nm. EVs wurden erstmals im Jahr 1978 mit Beweisen aus Vesikeln von Patienten mit Morbus Hodgkin1gemeldet. Diese Vesikel wurden berichtet, dass 40 bis 120 Nanometer groß. Im Jahr 1980 wurde berichtet, dass das Gerinnungssystem und Thrombose, Bildung eines Blutgerinnsels in einem Blutgefäß im Krebs Patienten2EVs beteiligt sind. Nach 30 Jahren berichtet die EVs ein wichtiger Faktor zur Förderung Tumorinvasion, immun Flucht und Angiogenese3sein. Darüber hinaus wurden die Funktionen des EFD als Regulatoren in zellulären Interaktionen in den Bereichen von Entzündungen, Immunschwäche, neurologische Erkrankungen und Krebs4untersucht. Da EVs bestimmte Biomoleküle wie Proteine, mRNA und MicroRNA5enthalten, wurde ihre mögliche Anwendung in der Diagnostik und Therapie analysierten6,7. Elektrofahrzeuge sind eine Kategorie bestehend aus Subgruppen Exosomen, Prostasomes, Oncosomes, Dexosomes, Mikropartikel, Promininosomes, Argosomes und Exosom-wie Bläschen, abhängig von ihrer zellulären Herkunft und biologische Funktion3. Darüber hinaus können basierend auf ihrer Biogenese, diese EVs Microvesicles (Schuppen Microvesicles, 100-1000 nm) und Exosomen (30-300 nm)8,9unterteilt werden. Unter anderem wurde die Exosom als Zelle Kommunikator für Immune Antwort10, Krebs11,12, ansteckende Krankheit13berichtet.
Schnell wachsendes Interesse an den Exosomen als Biomarker für die Früherkennung und die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen mit molekularen Bildgebungsverfahren einhergehen müssen. Die unterschiedlichen Größen und Morphologien von Exosomen, je nach ihrer Herkunft und Funktion14können durch Mikroskopiertechniken mit hoher Auflösung, wie z. B. Elektronenmikroskopie unterschieden werden. Die meisten Exosomen waren negativ gefärbten Transmission Electron Microscopy (TEM)15,16,17visualisiert, und diese Ergebnisse wurden durch Immunolabeling eines spezifischen Proteins im ganzen Berg Vesikel bestätigt 18. mehrere Forschergruppen haben die Struktur durch Scanning Electron Microscopy, Atomic Force Microscopy19,20und Cryo-TEM21,22berichtet. Während diese Techniken fürs Studium Exosom nützen, sind sie jedoch nicht ausreichend für die Position von bestimmten Proteinen befindet sich im Inneren die Exosom zu beobachten. Daher haben wir ein Protokoll für imaging Exosomen eines spezifischen Proteins Kennzeichnung eingeführt. Wir blockieren Vorbereitung, ultradünnen schneiden und Immunostaining für die Feststellung des Proteins detaillierte Standort in die Exosom angewendet. Dies war im Vergleich zu negative Färbung und ganze Berg Immunostaining, die traditionell zur Charakterisierung von die Exosom dient.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="583">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium cacodylate&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Osmium tetroxide 1 g crystal</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19100</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">acetone</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>1B2031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Spurr medium</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td style="width:119px;">18108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Ultra-microtome</td>
			<td style="width:81px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">UCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Lead citrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">H7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">nickel grid</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Copper grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">glycine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>022K5404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:81px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:81px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">25557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">1st Antibody</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">purification in manually&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">329710</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified Mouse IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">401202</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold (Control)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle</td>
			<td style="width:81px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">silver paint</td>
			<td style="width:81px;">CANS</td>
			<td style="width:119px;">CTP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">aluminum stub</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">75622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">FIB-SEM</td>
			<td style="width:81px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AURIGA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JEM2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JFC1100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Carbon grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">121119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-CU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated&#160; Nickel Grid (200 mesh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-NI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy

Exosomen Nanogrösse extrazelluläre Vesikel durch Körperflüssigkeiten ausgeschieden werden und sind dafür bekannt, die Eigenschaften der Zellen dar, die sie absondern. Den Inhalt und die Morphologie der sekretierten Vesikel reflektieren Zelle Verhalten oder physiologischer Zustand, zum Beispiel Zellwachstum, Migration, Spaltung und Tod. Die Exosomen Rolle kann hoch richten sich nach Größe und die Größe der Exosomen variiert zwischen 30 und 300 nm. Die am häufigsten verwendete Methode für die Exosom Bildgebung ist negative Färbung, während andere Ergebnisse auf Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie, Scanning Electron Microscopy und Atomic Force Microscopy basieren. Die typische Exosom Morphologie beurteilt durch negative Färbung ist eine Becherform, aber weitere Details sind noch nicht klar. Eine Exosom gut charakterisierten durch strukturelle Studie ist notwendig insbesondere im medizinischen und pharmazeutischen Bereich. Daher sollte Funktion-abhängige Morphologie durch Elektronenmikroskopie Techniken wie z. B. ein bestimmtes Protein in die detaillierte Struktur der Exosom Kennzeichnung bestätigt werden. Um detaillierte Struktur zu beobachten, wurden ultradünnen geschnittenen Bilder und negativ gefärbten Bilder von Exosomen verglichen. In diesem Protokoll empfehlen wir Transmissions-Elektronenmikroskopie für die Bildgebung von Exosomen einschließlich negative Färbung, ganze Berg Immuno-Färbung, Block Vorbereitung, Dünnschliff und Immuno-Gold Kennzeichnung.

Derzeit sind Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie in Größe und Form Kategorien eingeteilt. Abbildung 2 zeigt negative Exosom und immun-gekennzeichnete Exosom im ganzen Zuordnungsstatus gebeizt. Abbildung 3 zeigt geschnittenen Exosom und Immuno-gekennzeichnete Exosomen nach dünn schneiden. Immuno-Gold Färbung mit Antikörpern spezifischer Proteine wird verwendet, um positiv eine Exosom identifizieren und klassifizi...

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Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Techniken für Transmissions-Elektronenmikroskopie, einschließlich negative Färbung, ultradünnen schneiden für detaillierte Struktur und Immuno-Gold um die Positionen der spezifischen Proteine in Exosomen bestimmen Kennzeichnung notwendig.

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Forschung

Biologie

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...