Name: sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-04T13:00:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dal Bio-&#38; programma di sviluppo tecnologia medicale della National Research Foundation (NRF) &#38; finanziato dal governo coreano (MSIP &#38; MOHW) (n. 2016M3A9B6904244). Ringraziamo anche i membri del centro di ricerca Bioconvergence di medicinali per la purificazione di esosomi.

1. blocco preparazione, taglio, colorazione e di Imaging dell'esosomi
<ol>
	<li>Pallina gli esosomi da supernatante di coltura delle cellule HCT116 mediante centrifugazione a 100.000 x g per 1,5 h23. Rimuovere il surnatante della cultura e fissare attentamente il pellet di esosomi purificata con 1 mL di 2,5% glutaraldeide in soluzione di cacodilato di sodio 0.1 M (pH 7.0) per 1 h a 4 ° C. Per 0.1 M sodio cacodilato, sciogliere l'acido cacodilico 4,28 g in 160 mL di acqua distillata (DW). Regola...

<ol>
	<li>Friend, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+cell+lines+derived+from+a+patient+with+Hodgkin's+disease.">Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease.</a> Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).</li><li>Dvorak, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+shedding+and+coagulation.">Tumor shedding and coagulation.</a> Science. 212 (4497), 923-924 (1981).</li><li>Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+improved+methods+to+characterize+their+morphology,+RNA+content,+and+surface+protein+biomarkers.">Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers.</a> Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. , (2017).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li><li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+it+out:+regulation+of+exosome+loading.">Sorting it out: regulation of exosome loading.</a> Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).</li><li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Zaharie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Carried+microRNA-375+Inhibits+Cell+Progression+and+Dissemination+via+Bcl-2+Blocking+in+Colon+Cancer.">Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer.</a> J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).</li><li>Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+-+a+promising+avenue+for+the+detection+and+treatment+of+infectious+diseases?.">Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?.</a> Eur J Pharm Biopharm. , (2017).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Liu, X., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+electron+microscopy+reconstruction+of+the+exosome+complex+using+the+random+conical+tilt+method.">Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+exosomes+secreted+from+macrophages+extracted+by+different+methods.">Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods.</a> Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).</li><li>Mazzeo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion+by+eosinophils:+A+possible+role+in+asthma+pathogenesis.">Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva,+using+correlative+AFM,+FESEM,+and+force+spectroscopy.">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162 (2016).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Kim, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+controls+the+secretion+of+inflammatory+lysyl-tRNA+synthetase+in+exosomes+from+cancer+cells.">Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).</li><li>Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+biologic+characterization+of+exosomes+and+microvesicles+as+facilitators+of+HIV-1+infection+in+macrophages.">Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages.</a> J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).</li><li>Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+mediate+cell+contact-independent+ephrin-Eph+signaling+during+axon+guidance.">Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance.</a> J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>van Niel, G., Heyman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+cytoskeleton+and+intracellular+trafficking.+II.+Intestinal+epithelial+cell+exosomes:+perspectives+on+their+structure+and+function.">The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).</li></ol>

Questo articolo presenta un protocollo per osservare la struttura di esosomi dettagliate e l'etichettatura delle sue proteine specifiche. Macchiatura negativa è stata considerata come il miglior metodo per esosomi17di imaging. Questa tecnica convenzionale ha mostrato la struttura a forma di Coppa degli esosomi. Tuttavia, questa forma di Coppa è una forma di manufatto che può verificarsi a causa del processo di essiccazione. Cryo-TEM risultati hanno mostrato che gli esosomi hanno una struttura p...

Vescicole extracellulari (EVs) sono vescicole di bilayer del lipido secernute dalle cellule e loro dimensione varia tra 30 e 300 nm. SVE in primo luogo sono stati segnalati nel 1978, con evidenza dalle vescicole di pazienti con malattia di Hodgkin1. Queste vescicole sono state segnalate per essere 40 a 120 nanometri di dimensione. Nel 1980, è stato riferito che SVE sono coinvolti nel sistema di coagulazione e trombosi, formazione di un coagulo di sangue all'interno di un vaso sanguigno nel cancro pazienti2. Dopo 30 anni, EVs sono stati segnalati per essere un fattore importante per promuovere l'invasione del tumore, fuga immune e l'angiogenesi3. Inoltre, le funzioni del SVE sono state studiate come regolatori in interazioni cellulari nelle aree di infiammazione, disturbo immunitario, malattia neurologica e cancro4. Poiché EVs contengono specifici biomolecole come proteine, mRNA e microRNA5, loro potenziale applicazione in diagnostica e terapeutica è stato analizzato6,7. SVE sono una categoria composta da sottogruppi inclusi esosomi, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticelle, promininosomes, argosomes e vescicole esosomi-come, a seconda della loro origine cellulare e funzione biologica3. Inoltre, basato sulla loro biogenesi, queste SVE possono essere diviso in microvescicole (capannone microvescicole, 100-1000 nm) ed esosomi (30-300 nm)8,9. Tra questi, l'esosomi sono stato segnalato come un comunicatore cellulare per risposta immunitaria10, cancro11,12e13di malattia infettiva.
Interesse per gli esosomi come biomarcatore per la diagnosi precoce sono in rapido aumento, e la purificazione e caratterizzazione di esosomi devono essere accompagnati con tecniche di imaging molecolare. Le varie dimensioni e morfologie di esosomi, a seconda della loro origine e funzione14, possono essere distinto mediante tecniche di microscopia ad alta risoluzione, come il microscopio elettronico. La maggior parte gli esosomi sono stati visualizzati da negativo macchiato microscopia elettronica in trasmissione (TEM)15,16,17, e questi risultati sono stati confermati da immunolabeling di una proteina specifica in intero supporto vescicola 18. diversi gruppi di ricerca hanno riferito alla struttura tramite scansione microscopia elettronica, microscopia a forza atomica19,20e Cryo-TEM21,22. Tuttavia, mentre queste tecniche sono utili per studiare la struttura di esosomi, sono insufficienti per osservare la posizione di specifiche proteine all'interno del esosomi. Pertanto, abbiamo introdotto un protocollo per l'imaging di esosomi con una proteina specifica etichettatura. Abbiamo applicato il blocco preparazione, sezionamento ultrasottile e immunostaining per accertare la posizione dettagliata della proteina nell'esosomi. Questo è stato confrontato con macchiatura negativa e tutta immunostaining di Monte, che è tradizionalmente utilizzato per la caratterizzazione dell'esosomi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="583">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium cacodylate&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Osmium tetroxide 1 g crystal</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19100</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">acetone</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>1B2031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Spurr medium</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td style="width:119px;">18108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Ultra-microtome</td>
			<td style="width:81px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">UCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Lead citrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">H7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">nickel grid</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Copper grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">glycine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>022K5404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:81px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:81px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">25557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">1st Antibody</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">purification in manually&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">329710</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified Mouse IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">401202</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold (Control)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle</td>
			<td style="width:81px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">silver paint</td>
			<td style="width:81px;">CANS</td>
			<td style="width:119px;">CTP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">aluminum stub</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">75622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">FIB-SEM</td>
			<td style="width:81px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AURIGA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JEM2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JFC1100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Carbon grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">121119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-CU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated&#160; Nickel Grid (200 mesh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-NI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy

Gli esosomi sono vescicole extracellulari nanometriche secernute dai fluidi corporei e sono conosciuti per rappresentare le caratteristiche di cellule che secernono i loro. Il contenuto e la morfologia delle vescicole secrete riflettono comportamento delle cellule o stato fisiologico, ad esempio la crescita delle cellule, migrazione, scissione e la morte. Ruolo degli esosomi può altamente dipende dalla dimensione e la dimensione degli esosomi varia da 30 a 300 nm. Il metodo più ampiamente usato per l'imaging di esosomi è macchiatura negativa, mentre altri risultati si basano su microscopia elettronica di Cryo-trasmissione, microscopia a scansione e microscopia a forza atomica. Morfologia di esosomi tipici valutato tramite colorazione negativa è a forma di Coppa, ma ulteriori dettagli non sono ancora chiari. Un esosomi ben caratterizzati attraverso studio strutturale sono necessaria particolare in campo medico e farmaceutico. Di conseguenza, funzione dipendente dalla morfologia deve essere verificata mediante tecniche di microscopia elettronica quali etichettatura una proteina specifica in struttura dettagliata di esosomi. Per osservare la struttura dettagliata, sono state confrontate ultrasottile immagini sezionate e immagini negative macchiate di esosomi. In questo protocollo, consigliamo di microscopia elettronica di trasmissione per l'imaging di esosomi incluse macchiatura negativa intero Monte immunocolorazione, preparazione di blocco, sezione sottile ed etichettatura immuno-oro.

Attualmente, gli esosomi sono classificati in categorie di forma e dimensioni da microscopia elettronica di trasmissione. La figura 2 Mostra negativo macchiato esosomi e immunitario-etichettati esosomi intero supporto dello stato. La figura 3 Mostra sezionato esosomi e immuno-etichettati esosomi dopo taglio sottile. Immuno-oro che macchia usando gli anticorpi di specifiche proteine viene utilizzato positivamente un esosomi di ide...

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Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Questo protocollo descrive le varie tecniche necessarie per microscopia elettronica di trasmissione tra cui macchiatura negativa, sezionamento ultrasottile per struttura dettagliata e immuno-oro etichettatura per determinare le posizioni di specifiche proteine in esosomi.

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

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JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

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Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

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