Name: sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-04T13:00:00
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이 연구는 생물에 의해 지원 되었다 &#38; 의료 기술 개발 프로그램 국가 연구 재단 (NRF)의 &#38;는 정부에 의해 투자 (MSIP &#38; 보건복지부) (No. 2016M3A9B6904244). 우리는 또한 exosome의 정화의 약용 Bioconvergence 연구 센터의 회원을 감사합니다.

1. 블록 준비, 단면, 얼룩이 지 고는 Exosome의 이미징
<ol>
	<li>1.5 h23에 대 한 100000 x g에서 원심 분리에 의해 HCT116 세포의 문화 상쾌한에서 exosomes을 펠 렛. 표면에 뜨는 문화를 제거 하 고 신중 하 게 순화 exosome 펠 릿 1 mL의 0.1 M 나트륨 cacodylate 솔루션 (pH 7.0) 4 ° c.에 1 시간에에서 2.5%도 해결 0.1 M 나트륨 cacodylate, 160 ml 증류수 (DW) 4.28 g cacodylic 산 분해. 0.1 M HCl 최대 200 mL 증류수와 함께 ...

<ol>
	<li>Friend, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+cell+lines+derived+from+a+patient+with+Hodgkin's+disease.">Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease.</a> Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).</li><li>Dvorak, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+shedding+and+coagulation.">Tumor shedding and coagulation.</a> Science. 212 (4497), 923-924 (1981).</li><li>Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-8+controls+the+secretion+of+inflammatory+lysyl-tRNA+synthetase+in+exosomes+from+cancer+cells.">Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells.</a> J Cell Biol. , (2017).</li><li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes.">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).</li><li>Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>van Niel, G., Heyman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+cytoskeleton+and+intracellular+trafficking.+II.+Intestinal+epithelial+cell+exosomes:+perspectives+on+their+structure+and+function.">The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).</li></ol>

이 문서는 자세한 exosome의 구조를 관찰 하 고 그 특정 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜을 표시 합니다. 부정적인 얼룩 exosome17이미징에 대 한 최선의 방법으로 간주 되었습니다. 이 기본 기술을 exosomes의 컵 모양의 구조를 보이고 있다. 그러나,이 컵 모양 인 위 건조 과정으로 인해 발생할 수 있는 형태입니다. 곳을 알아내는 가장 결과 exosomes 용액25,<sup clas...

Extracellular 소포 (EVs) 지질 bilayer 소포 세포에 의해 분 비 되며 그들의 크기 범위는 30 300 nm 사이. EVs는 Hodgkin의 질병1환자의 소포에서 증거와 함께 1978 년에 처음 보고 되었다. 이러한 vesicles 40 ~ 120 나노미터 크기에 보고 했다. 1980 년에, 그것은 EVs 응고 시스템 및 혈전 증, 암 환자2혈관 내 혈액 응고의 형성에 관련 된 것으로 알려졌다. 30 년 후, EVs 종양 침공, 면역 탈출 및 신생3홍보 하는 중요 한 요소 되도록 보고 되었습니다. 또한, EVs의 기능 세포의 상호 작용 분야에서 염증, 면역 장애, 신경 질환 및 암4레 귤 레이 터로 공부 되었다. EVs는 특정 생체 단백질, mRNA, 예측에 관한5등 포함, 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램 분석된6,7되었습니다. EVs는 exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, 미, promininosomes, argosomes, 및 그들의 세포질 근원 및 생물학 기능3에 따라 exosome 같은 소포를 포함 한 하위의 구성 범주. 또한, 그들의 속에 따라, 이러한 EVs 수 나눌 수 microvesicles (창 고 microvesicles, 100-1000 nm) 및 exosomes (30-300 nm)8,9. 이러한 가운데,는 exosome 면역 응답10, 암11,12, 및 전염병13셀 의사 소통으로 보고 되었습니다.
조기 진단 위한 바이오 마커도 exosomes에 대 한 관심, 고 정화와 exosomes의 분자 이미징 기술을 함께 동반 되어야 합니다. 다양 한 크기와 exosomes, 그들의 기원과 기능14, 따라의 형태학은 전자 현미경과 같은 높은 해상도와 현미경 기법에 의해 구분할 수 있습니다. 대부분 exosomes 부정적인 스테인드 전송 전자 현미경 (TEM)15,,1617에 의해 시각 했다 그리고이 결과 전체 산 소포에 특정 단백질의 immunolabeling에 의해 확인 되었다 18. 여러 연구 그룹 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경19,20및 Cryo 편21,22를 통해 구조를 보고 있다. 그러나, 이러한 기술은 exosome 구조를 공부 하는 데 유용 하는 동안 그들은 충분 하지 않습니다는 exosome 안에 있는 특정 단백질의 위치를 관찰. 따라서, 우리는 특정 단백질의 라벨로 exosomes 이미징에 대 한 프로토콜 도입. 우리 블록 준비, ultrathin 단면화 및 immunostaining에 있는 exosome 단백질의 자세한 위치를 ascertaining에 대 한 적용. 이 부정적인 얼룩이 지 고는 exosome의 전통적으로 사용 되는 전체 산 immunostaining와 비교 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="583">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">16200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium cacodylate&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Osmium tetroxide 1 g crystal</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19100</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">acetone</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>1B2031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Spurr medium</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td style="width:119px;">18108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Ultra-microtome</td>
			<td style="width:81px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">UCT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Lead citrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">H7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">nickel grid</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Copper grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">glycine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>022K5404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:81px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:81px;">Aurion</td>
			<td style="width:119px;">25557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">1st Antibody</td>
			<td style="width:81px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">purification in manually&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">329710</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Purified Mouse IgG2b, &#954; Isotype Ctrl</td>
			<td style="width:81px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">401202</td>
			<td style="width:167px;">Whole mount Immumogold (Control)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle</td>
			<td style="width:81px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">silver paint</td>
			<td style="width:81px;">CANS</td>
			<td style="width:119px;">CTP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">aluminum stub</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">75622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">FIB-SEM</td>
			<td style="width:81px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AURIGA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Transmission Electron Microscopy</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JEM2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:81px;">JEOL</td>
			<td style="width:119px;">JFC1100E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Carbon grid</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">121119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-CU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Formvar carbon coated&#160; Nickel Grid (200 mesh)</td>
			<td style="width:81px;">EMS</td>
			<td style="width:119px;">FCF200-NI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
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sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy

Exosomes는 나노 크기의 세포 외 체액 분 비 소포 그리고 그들을 분 비 하는 셀의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 내용과 secreted vesicles의 형태 셀 행동 또는 생리 적 상태, 예를 들면 세포 성장, 마이그레이션, 분열, 그리고 죽음을 반영합니다. Exosomes의 역할 매우 크기에 따라 달라질 수 있습니다 따라 다르며 exosomes의 크기 30에서 300 nm. Exosome 이미징에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 부정적인 얼룩, Cryo-전송 전자 현미경, 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경을 기반으로 하는 다른 결과 이다. 전형적인 exosome 형태학 부정적인 얼룩 통해 평가 컵 모양 이지만 더 세부 사항은 아직 명확. 구조 연구를 통해 잘 특징이 있는 exosome 의료 및 제약 분야에서 필요한 특히 이다. 따라서, 함수 종속 형태 라벨 exosome의 상세한 구조에서 특정 단백질 등 전자 현미경 기법에 의해 확인 되어야 한다. 자세한 구조를 관찰, ultrathin sectioned 이미지와 exosomes의 부정적인 스테인드 이미지 비교 되었다. 이 프로토콜에서 부정적인 얼룩이 지기, 전체 마운트 immuno 얼룩이, 블록 준비, 얇은 섹션, 그리고 면역-골드 라벨을 포함 하 여 exosomes의 영상에 대 한 전송 전자 현미경 검사 법 하는 것이 좋습니다.

현재, exosomes 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 크기와 모양 범주로 분류 됩니다. 그림 2 는 부정적인 exosome 및 전체 마운트 상태에 면역 이라는 exosome 스테인드. 그림 3 얇은 단면 후 sectioned exosome와 면역 이라는 exosomes를 보여준다. 면역-골드 얼룩 특정 단백질의 항 체를 사용 하 여 긍정적으로 exosome 식별은 exosome 단백질의 종류를...

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Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Research

JoVE Journal

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

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