Name: a primary human trophoblast model to study the effect of inflammation associated with maternal obesity on regulation of autophagy in the placenta
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta at JoVE.com

המחברים תודה נשים שתרמה שלהם מאחד לשני במחקר זה. אנו מודים גם את העבודה ואת משלוח במחלקת OHSU ואת Maternal צוות המחקר העוברי לתיאום איסוף מאחד לשני. אנו אסירי תודה אריק וונג, Ph.d., ו קלי קואו, MD לתמיכה, לעזור עם שיטות נסיוניות ואופטימיזציה.
עבודה זו מומן על ידי NIH HD076259A (AM) ו AHA GRNT29960007 (AM).

placentae נאספו מן העבודה היחידה המסירה בבית החולים האוניברסיטאי תחת פרוטוקול אושרה על ידי המוסדיים סקירה של אורגון הבריאות אוניברסיטת המדע בפורטלנד, אורגון, עם הסכמה מדעת של חולים.
 1. אוסף של רקמות היפרדות <ol><li>הכנת הערה: כל הציוד נתקל רקמות חייבת להיות סטרילי.
	<ol>...

<ol>
	<li>Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+obesity.">Inflammatory mechanisms in obesity.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).</li><li>van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+in+cancer+treatment:+molecular+insights,+antitumor+effects,+and+clinical+utility.">TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility.</a> Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).</li><li>Yogev, Y., Catalano, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy+and+obesity.">Pregnancy and obesity.</a> Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregravid+obesity+associates+with+increased+maternal+endotoxemia+and+metabolic+inflammation.">Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).</li><li>Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+miR-210+expression+and+mitochondrial+dysfunction+in+the+placenta+with+maternal+obesity.">Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity.</a> Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).</li><li>Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+placental+function.">Obesity and placental function.</a> Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).</li><li>Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+body+mass+index+and+the+risk+of+fetal+death,+stillbirth,+and+infant+death:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).</li><li>Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boys+live+dangerously+in+the+womb.">Boys live dangerously in the womb.</a> Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).</li><li>Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+to+human+placenta.">Trophoblast to human placenta.</a> Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).</li><li>Bax, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+changes+and+immunocytochemical+analysis+of+human+placental+trophoblast+during+short-term+culture.">Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture.</a> Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).</li><li>Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+cytotrophoblast+cells+and+in+vitro+methods+for+studying+human+cytotrophoblast+cells'+calcium+uptake.">Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake.</a> Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).</li><li>Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+activation+of+placental+autophagy+in+obese+women+with+evidence+for+fetal+programming+from+a+placenta-specific+mouse+model.">Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model.</a> Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).</li><li>Matsunaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Beclin+1-binding+proteins,+Atg14L+and+Rubicon,+reciprocally+regulate+autophagy+at+different+stages.">Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages.</a> Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regulation+of+autophagic+activity+by+Atg14L+and+Rubicon+associated+with+Beclin+1-phosphatidylinositol-3-kinase+complex.">Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex.</a> Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).</li><li>Yang, C. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Protein+Rubicon+Mediates+Phagocytic+NADPH+Oxidase+Activation+in+Response+to+Microbial+Infection+or+TLR+Stimulation.">Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).</li><li>Yang, C. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy+Regulator+Rubicon+Is+a+Feedback+Inhibitor+of+CARD9-Mediated+Host+Innate+Immunity.">The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).</li><li>Zi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rubicon+deficiency+enhances+cardiac+autophagy+and+protects+mice+from+lipopolysaccharide-induced+lethality+and+reduction+in+stroke+volume.">Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).</li><li>Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+function+in+human+placenta+with+increased+maternal+adiposity.">Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).</li><li>Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+pregnancy:+the+role+of+the+immune+system+at+the+implantation+site.">Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site.</a> Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).</li><li>Resi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+inflammation+and+adipose+tissue+matrix+remodeling+precede+physiological+adaptations+to+pregnancy.">Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Virgin, H. W., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+in+immunity.">Autophagy genes in immunity.</a> Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).</li><li>Sagrillo-Fagundes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Primary+Trophoblast+Cell+Culture+Model+to+Study+the+Protective+Effects+of+Melatonin+Against+Hypoxia/reoxygenation-induced+Disruption.">Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption.</a> JoVE. (113), (2016).</li><li>Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+obesity,+inflammation,+and+developmental+programming.">Maternal obesity, inflammation, and developmental programming.</a> Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+in+serum+of+patients+with+inflammatory+bowel+disease+as+measured+by+a+highly+sensitive+immuno-PCR.">Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR.</a> Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).</li><li>Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+Rubicon+to+cross+the+Rubicon.">Binding Rubicon to cross the Rubicon.</a> Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).</li></ol>

השליה, אחראית להסדרת הצמיחה של העובר, תערוכות פונקציה פרוץ ב סביבה שמנים6. למרות דרישות המטבולית גבוהה של trophoblasts, מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית התערוכה מתפקדת נשימה מיטוכונדריאלי6,19. שינויים בחילוף החומרים היפרדות עשוי לתרום שכיחות מוגברת של סי...

השמנת יתר היא מדינה דלקתית המאופיינת בדרגה נמוכה דלקת כרונית, הנובעות רקמת שומן עודף וזמינות חומר מזין. ההשמנה, ציטוקינים proinflammatory גבוהות ברקמות מטבולית וכן מערכתית במחזור. גוף חזקים של הראיות הוכיחו כי TNFα הוא משמעותי גבוה בסביבה של השמנת יתר עם השלכות תנגודת לאינסולין ואת תפקוד מטבולי1. הפעלה של TNFα תורם גם מחלת פתוגנזה בתנאים כגון סרטן, מחלת חיסון עצמי, הפיכתה ליעד אטרקטיבי טיפולית של2.
דלקת ההשמנה מורכב ההריון, גם proinflammatory המדינה3,4. בעבר הוכח כי תוכן TNFα היפרדות מגביר עם השמנה אימהי של הריונות עם העוברים הנשי. יתר על כן, הטיפול TNFα מעכב נשימה מיטוכונדריאלי בתאים trophoblast נקבה אך לא זכר, רומז כי TNFα מעורב בוויסות חילוף החומרים היפרדות בצורה מינית dimorphic5. השמנת יתר אימהית קשורה עם שכיחות מוגברת של מגוון רחב של סיבוכים במהלך ההריון, כולל לידות, בעוברים זכרים להיות רגישים ביותר3,6,7,8 . בשל תפקידה מפתח-הממשק אמהי-עוברית, שינויים ביכולת תפקודית של השליה ב התוך-רחמית שמנים בתגובה איתות דלקתיות עשוי לשחק תפקיד חשוב תיווכה התוצאות של הריונות מהשמנת יתר.
Cytotrophoblasts syncytiotrophoblasts בתוך הרקמה villous חלקית של השליה הם קריטיים עבור איתות האנדוקרינית ו- exchange חומרי מזון וחמצן בין האם לעובר המתפתח9. שיבושים ביכולת תפקודית של cytotrophoblasts villous חלקית (ןלהל trophoblasts) עלול לסכן את בריאות העובר והתפתחות. פרוטוקול זה מתאר שיטת דגימה של רקמת villous חלקית של השליה האנושית המונח על ידי לנתח משם את הצלחות שליה, הבסיס יחד עם שגרת ממוטב עבור בידודו של trophoblasts לתרבות התא הראשי. פרוטוקול זה נגזר מתודולוגיות הוקמה מעורבים עיכול אנזימטי של רקמות villous חלקית כדי לשחרר תאים מטריצה חוץ-תאית ואחריו צפיפות דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי לבודד trophoblasts10, 11,12. פרוטוקול זה פרטים גישה שבה trophoblasts העיקרי של מאחד לשני של הריונות רזה מטופלים עם תרבות המדיה בתוספת TNFα כדי לדמות מרכיב אחד של הסביבה שבה התרחשה דלקתיות הקשורות בהשמנת יתר אימהית. לבסוף, מתואר הליך פשוט לשימוש בתא סכום lysates מן trophoblasts שטופלו TNFα ואחריו המערבי סופג כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים.
בעוד מודל זה לא מסכם את הדברים obesogenic בתוך הרחם הסביבה בשלמותו, הוא מספק מערכת מבוקרת המאפשר אחד כדי לנתח את תרומתו של הפרט של דלקת בתיווך TNFα בתגובה של trophoblasts השמנת יתר אימהית. מודל זה מעניק את ההזדמנות לגלות או לאשר את מטרות מולקולריות ישירות מוסדר על ידי TNFα איתות ב trophoblasts, כמו גם מאפשר לבדוק אם שינויים בדפוסי ביטוי גנים נצפתה ויוו ב מאחד לשני עם אימהית השמנת יתר עשוי להיות תוצאה של דלקת בתיווך TNFα.
הגישה המתוארת כאן בוצע כדי לבחון את ההשפעה של דלקת בתיווך TNFα על ויסות autophagy ב trophoblasts האנושית. Trophoblasts של הריונות שמנים עם נספח בעוברים זכרים משובשות מחזור autophagic, או autophagosome ההבשלה13. חלבון הנקרא רוביקון (בניהול תחום חלבון אינטראקציה-Beclin1 וציסטאין-עשיר המכיל), אשר הוא מקומי אל lysosomes ואל endosomes המאוחרות, לאחרונה מתוארת כ "בלימה" בתהליך מחזור autophagic כי הוא פועל כמו שלילי הרגולטור של autophagosome-התבגרות-14,-15. למעשה, רוביקון הוא דוגמה נדירה של חלבון זה מרסן autophagy, מה שהופך אותה מטרה טיפולית יקרי ערך. מעט מאוד מידע זמין למשמעות pathophysiological רוביקון, למעט תפקידים שלה בתגובה חיסונית מולדת microbials16,17 ו cardiomyocyte הגנה18. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן הוא נמצא כי רוביקון היא upregulated ב trophoblasts הראשי הנשי בתגובה לטיפול עם הגדלת ריכוזי TNFα עד 250 pg/mL. ברגולציה של רוביקון עשוי לשחק תפקיד איך נשים שהעוברים הנסיעה יותר גברים הריונות עם השמנת יתר אימהית. Recapitulating דלקת הקשורים עם השמנת יתר אימהית ex-vivo על ידי חשיפת האדם trophoblasts ל אקסוגניים TNFα מספק פלטפורמה לחקור את ההשפעה של התוך-רחמית מהשמנת יתר על התקנון של נתיבים קריטיים ב trophoblasts על ידי הרחבת, הפונקציה היפרדות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (anhyd.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 (anhyd.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/Phosphatase inhibitors</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>88668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6228822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Calf Serum (NCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26010-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-427-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3177-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA vacutainer blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (Density Gradient Media, DGM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubicon (D9F7) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>8465S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-Actin antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a primary human trophoblast model to study the effect of inflammation associated with maternal obesity on regulation of autophagy in the placenta

השמנת יתר אימהית קשורה לסיכון מוגבר של תוצאות שליליות הלידה זה סביר בתיווך פרוץ פונקציה היפרדות ניתן לייחס, בין השאר, dysregulation של autophagy. חריגה שינויים בביטוי של הרגולטורים autophagy ב מאחד לשני של הריונות מהשמנת יתר עשוי להיות מפוקח על ידי תהליכים דלקתיים המשויכים השמנת יתר והריון. המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמת villous חלקית ובידוד של cytotrophoblasts villous חלקית של השליה האנושית המונח לתרבות התא הראשי. זה מלווה שיטה כדי לדמות את חצרו דלקתיות ב התוך-רחמית מהשמנת יתר על ידי טיפול trophoblasts העיקרי של הריונות רזה עם הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNFα), ציטוקינים proinflammatory כי הוא גבוה ב השמנת יתר הריון. תוך יישום הפרוטוקול המתואר כאן, הוא נמצא כי החשיפה ל אקסוגניים TNFα מווסת את הביטוי של רוביקון, מווסת שלילי של autophagy, ב- trophoblasts של הריונות רזה עם העוברים הנשי. בעוד מגוון רחב של גורמים ביולוגיים התוך-רחמית שמנים לשמור על פוטנציאל לווסת נתיבים קריטיים ב- trophoblasts, מערכת זו שמחוץ היא שימושית במיוחד עבור קביעת אם הביטוי תבניות שנצפה ויוו אנושי מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית הם תוצאה ישירה של TNFα איתות. בסופו של דבר, גישה זו מעניקה הזדמנות לנתח את ההשלכות רגולטוריות ומולקולרית של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על autophagy מסלולים אחרים קריטי הסלולר ב trophoblasts שיש להם פוטנציאל לפגיעה פונקציית היפרדות.

מונח אנושי מאחד לשני מ רזה (מדד מסת הגוף שלפני ההריון (BMI) &#60; 25) אמהות עם הריונות מסובכת נושאת צאצאים נקבות היו נאספים, שנדגמו תוך 15 דקות מרגע הלידה בניתוח קיסרי (ללא עבודה). מאחד לשני נבחנו בהעדר calcifications ופיתוח טיפוסי: שקילה בין 300-600 גרם עם חבל הטבור ממברנות הוסר, עגול בצורת, ...

Watch this Scientific Journal Video about A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta at JoVE.com

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.

מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

ניצול גירוי מגנטי Transcranial לחקר מערכת Neuromuscular האדם

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

שימוש Saccadometry עם דיפ גירוי המוח לחקר תפקוד מוח נורמלי ופתולוגיים

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית: כלי למדידת<em&gt; In vivo</em&gt; קיבולת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי של שריר שלד אדם

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

ההשפעה של ניסוחים דמעה מלאכותית על הפעילות המטבולית של תאי אפיתל הקרנית האנושית לאחר חשיפה להתייבשות

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...