Name: a primary human trophoblast model to study the effect of inflammation associated with maternal obesity on regulation of autophagy in the placenta
Uploaded: 2017-09-27T15:00:00
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Gli autori ringraziano le donne che hanno donato loro placente per questo studio. Ringraziamo anche il dipartimento di consegna al OHSU e materno e fetale Team di ricerca e lavoro per coordinare la raccolta di placente. Siamo grati a Eric Wang, pH.d. e Kelly Kuo, MD per supporto e aiuto con metodi sperimentali e ottimizzazione.
Questo lavoro è stato finanziato da NIH HD076259A (AM) e AHA GRNT29960007 (AM).

placente sono stati raccolti dall'unità di consegna all'ospedale universitario e del lavoro nell'ambito di un protocollo approvato dall'istituzionale Review Board of Oregon Health and Science University a Portland, Oregon, con il consenso informato il pazienti.
 1. raccolta di tessuto placentare <ol><li>preparazione Nota: tutte le attrezzature che incontra il tessuto devono essere sterile.
	<ol><li>L'apparecchiatura per dissezione di sterilizzare in autoclave per 60 ...

<ol>
	<li>Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+obesity.">Inflammatory mechanisms in obesity.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).</li><li>van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+in+cancer+treatment:+molecular+insights,+antitumor+effects,+and+clinical+utility.">TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility.</a> Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).</li><li>Yogev, Y., Catalano, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy+and+obesity.">Pregnancy and obesity.</a> Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregravid+obesity+associates+with+increased+maternal+endotoxemia+and+metabolic+inflammation.">Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation.</a> Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).</li><li>Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+miR-210+expression+and+mitochondrial+dysfunction+in+the+placenta+with+maternal+obesity.">Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity.</a> Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).</li><li>Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+placental+function.">Obesity and placental function.</a> Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).</li><li>Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+body+mass+index+and+the+risk+of+fetal+death,+stillbirth,+and+infant+death:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).</li><li>Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boys+live+dangerously+in+the+womb.">Boys live dangerously in the womb.</a> Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).</li><li>Kliman, H. J., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+to+human+placenta.">Trophoblast to human placenta.</a> Enc. Reprod. 4, 834-846 (1999).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).</li><li>Bax, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+changes+and+immunocytochemical+analysis+of+human+placental+trophoblast+during+short-term+culture.">Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture.</a> Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).</li><li>Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+cytotrophoblast+cells+and+in+vitro+methods+for+studying+human+cytotrophoblast+cells'+calcium+uptake.">Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake.</a> Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).</li><li>Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+activation+of+placental+autophagy+in+obese+women+with+evidence+for+fetal+programming+from+a+placenta-specific+mouse+model.">Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model.</a> Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).</li><li>Matsunaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Beclin+1-binding+proteins,+Atg14L+and+Rubicon,+reciprocally+regulate+autophagy+at+different+stages.">Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages.</a> Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+regulation+of+autophagic+activity+by+Atg14L+and+Rubicon+associated+with+Beclin+1-phosphatidylinositol-3-kinase+complex.">Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex.</a> Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).</li><li>Yang, C. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Protein+Rubicon+Mediates+Phagocytic+NADPH+Oxidase+Activation+in+Response+to+Microbial+Infection+or+TLR+Stimulation.">Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).</li><li>Yang, C. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autophagy+Regulator+Rubicon+Is+a+Feedback+Inhibitor+of+CARD9-Mediated+Host+Innate+Immunity.">The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity.</a> Cell Host &amp; Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).</li><li>Zi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rubicon+deficiency+enhances+cardiac+autophagy+and+protects+mice+from+lipopolysaccharide-induced+lethality+and+reduction+in+stroke+volume.">Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).</li><li>Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+function+in+human+placenta+with+increased+maternal+adiposity.">Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).</li><li>Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+pregnancy:+the+role+of+the+immune+system+at+the+implantation+site.">Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site.</a> Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).</li><li>Resi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+inflammation+and+adipose+tissue+matrix+remodeling+precede+physiological+adaptations+to+pregnancy.">Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).</li><li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+immunity+and+inflammation.">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li><li>Virgin, H. W., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+genes+in+immunity.">Autophagy genes in immunity.</a> Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).</li><li>Sagrillo-Fagundes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Primary+Trophoblast+Cell+Culture+Model+to+Study+the+Protective+Effects+of+Melatonin+Against+Hypoxia/reoxygenation-induced+Disruption.">Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption.</a> JoVE. (113), (2016).</li><li>Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+obesity,+inflammation,+and+developmental+programming.">Maternal obesity, inflammation, and developmental programming.</a> Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).</li><li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+in+serum+of+patients+with+inflammatory+bowel+disease+as+measured+by+a+highly+sensitive+immuno-PCR.">Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR.</a> Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).</li><li>Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+Rubicon+to+cross+the+Rubicon.">Binding Rubicon to cross the Rubicon.</a> Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).</li></ol>

La placenta, responsabile della regolazione della crescita del feto, esibisce funzione compromessa in obesi ambiente6. Nonostante le elevate esigenze metaboliche di trofoblasto, placente con l'obesità materna esibiscono disfunzionali respirazione mitocondriale6,19. Cambiamenti nel metabolismo placenta possono contribuire all'aumento di incidenza di complicanze e i risultati fetali avversi osservati in gravidanze obesi3</...

L'obesità è uno stato infiammatorio caratterizzato da infiammazione cronica, derivante dal tessuto adiposo in eccesso e disponibilità di nutrienti. Nell'obesità, citochine proinfiammatorie sono elevate nei tessuti metabolici così come sistematicamente in circolazione. Un robusto corpo di prova ha dimostrato che TNFα è significativamente elevato nella regolazione dell'obesità con implicazioni in insulino-resistenza e disfunzione metabolica1. Attivazione di TNFα contribuisce alla patogenesi della malattia in condizioni come il cancro e l'autoimmunità, che lo rende un obiettivo terapeutico attraente2.
L'infiammazione nell'obesità è aggravata dalla gravidanza, inoltre, un stato proinflammatory3,4. Precedentemente è stato indicato che placentare TNFα contenuto aumenta con adiposità materna nelle gravidanze con feti di sesso femminile. Inoltre, il trattamento di TNFα inibisce la respirazione mitocondriale nelle cellule del trofoblasto femminile ma non male, suggerendo che il TNFα è coinvolto nella regolazione del metabolismo placenta in un modo sessualmente dimorphic5. L'obesità materna è associata con l'incidenza aumentata di una varietà di complicazioni durante la gravidanza, tra cui il feto nato morto, con feti maschi, essendo il più suscettibile3,6,7,8 . Dovuto il relativo ruolo chiave a livello di interfaccia materno-fetale, cambiamenti nella capacità funzionale della placenta nell'ambiente intrauterino obeso in risposta alla segnalazione infiammatoria possono svolgere un ruolo importante nel mediare gli esiti delle gravidanze obesi.
Cytotrophoblasts e syncytiotrophoblasts nel tessuto dei villi della placenta sono fondamentali per la segnalazione endocrina e scambio di nutrienti e ossigeno tra la madre e sviluppo feto9. Interruzioni nella capacità funzionale di villous cytotrophoblasts (in appresso denominato trofoblasto) possono compromettere lo sviluppo e la salute del feto. Questo protocollo descrive un metodo per il campionamento del tessuto dei villi della placenta umana a termine distanza dissezionando le piastre corioniche e basale insieme a una procedura ottimizzata per l'isolamento di trofoblasti per colture cellulari primarie. Questo protocollo è derivato da metodologie consolidate che coinvolgono digestione enzimatica del tessuto villous di rilasciare cellule dalla matrice extracellulare seguita da centrifugazione differenziale densità per isolare trofoblasti10, 11,12. Questo dettagli del protocollo un approccio in cui primari trofoblasti da placente da gravidanze magre sono trattati con mezzi di coltura completati con TNFα per simulare un componente del milieu infiammatorio associato con l'obesità materna. Infine, è descritta una procedura semplice per la raccolta lisati cellulari totali dal trofoblasto TNFα-trattati, seguita da Western blotting per rilevare i cambiamenti nell'espressione genica.
Mentre questo modello non ricapitolare obesogenico nell'utero ambiente nella sua interezza, esso fornisce un sistema controllato che permette di analizzare il contributo individuale di TNFα-mediata di infiammazione in risposta dei trofoblasti a obesità materna. Questo modello offre sia l'opportunità di scoprire o confermare bersagli molecolari direttamente disciplinate dal TNFα segnalazione nel trofoblasto, nonché permette di verificare se i cambiamenti nel pattern di espressione genica osservati in vivo in placente con materna l'obesità può essere un risultato di infiammazione TNFα-mediata.
L'approccio qui descritto è stato implementato per testare l'effetto di infiammazione TNFα-mediata sulla regolazione dell'autofagia nel trofoblasto umano. Trofoblasto da obese gravidanze con feti di sesso maschile Mostra perturbato autofagica fatturato o autofagosoma maturazione13. Una proteina chiamata Rubicon (RUN dominio proteina d'interazione Beclin1 e ricche di cisteina contenente), che è localizzato per i lisosomi e late endosomes, recentemente è stata descritta come un "freno" nel processo di autofagia fatturato perché funziona come un negativo regolatore di autofagosoma maturazione14,15. Infatti, il Rubicon è un raro esempio di una proteina che trattiene l'autofagia, che lo rende un prezioso obiettivo terapeutico. Poche informazioni sono disponibili circa il significato patofisiologico di Rubicon, fatta eccezione per i suoi ruoli nella risposta immunitaria innata a microbials16,17 e del cardiomyocyte protezione18. Mediante il protocollo descritto qui, si è constatato che il Rubicon è upregulated nel trofoblasto femminile primario in risposta al trattamento con aumento delle concentrazioni di TNFα fino a 250 pg/mL. Il regolamento di Rubicon può svolgere un ruolo in come femmina feti tariffa migliore rispetto ai maschi nelle gravidanze con l'obesità materna. Ricapitolando l'infiammazione associata con l'obesità materna ex vivo esponendo trofoblasto umano di TNFα esogena fornisce una piattaforma per studiare l'impatto dell'ambiente intrauterino obeso sulla regolamentazione dei percorsi critici in trofoblasto e, per estensione, la funzione placentare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10X HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (anhyd.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 (anhyd.)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp.</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/Phosphatase inhibitors</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>88668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ6228822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Calf Serum (NCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26010-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-427-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3177-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70013-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA vacutainer blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>366450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (Density Gradient Media, DGM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-900-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubicon (D9F7) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>8465S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-&#946;-Actin antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2228-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34578</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a primary human trophoblast model to study the effect of inflammation associated with maternal obesity on regulation of autophagy in the placenta

L'obesità materna è associata con un rischio aumentato di esiti perinatali negativi che sono probabilmente mediati da compromissione della funzione placentare che può essere attribuito, in parte, la disregolazione dell'autofagia. Aberrante cambiamenti nell'espressione di regolatori dell'autofagia in placente da gravidanze obese possono essere regolati tramite i processi infiammatori connessi con l'obesità e la gravidanza. Un protocollo per il campionamento del tessuto villous e isolamento di cytotrophoblasts dei villi della placenta umana a termine per colture cellulari primarie è descritto qui. Questa è seguita da un metodo per simulare il milieu infiammatorio nell'ambiente intrauterino obeso trattando trofoblasti primari da magre gravidanze con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF), una citochina proinflammatory che è elevata nell'obesità e nella gravidanza. Attraverso l'implementazione del protocollo descritto qui, è trovato che l'esposizione a esogeno TNFα regola l'espressione di Rubicon, un regolatore negativo dell'autofagia, nel trofoblasto da magre gravidanze con feti di sesso femminile. Mentre una varietà di fattori biologici nell'ambiente intrauterino obeso mantenere il potenziale di modulare le vie critiche nel trofoblasto, questo sistema ex vivo è particolarmente utile per determinare se espressione modelli osservata in vivo in placente umane con l'obesità materna sono un risultato diretto di TNFα segnalazione. In definitiva, questo approccio offre l'opportunità di analizzare le implicazioni normative e molecolare di infiammazione associata con l'obesità materna su autophagy e su altre vie cellulari critici nel trofoblasto che hanno il potenziale di impatto funzione placentare.

Termine le placente umane dal magro (pre-gravidanza massa corporea (BMI) &#60; 25) le madri con gravidanze semplici che trasportano prole femminile sono stati raccolti e campionate entro 15 minuti di consegna dalla sezione cesarean (non lavoro). Le placente sono state esaminate per l'assenza di calcificazioni e sviluppo tipico: peso compreso tra 300-600 g con il cordone ombelicale e membrane rimosse, rotondo in forma, tra 15-25 cm di diametro e inserito nel mezzo del cordone ombelicale la...

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A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Presentato qui è un protocollo per il campionamento del tessuto villous placenta umano seguito da isolamento di cytotrophoblasts per colture cellulari primarie. Trattamento del trofoblasto con TNFα ricapitola l'infiammazione nell'ambiente intrauterino obeso e facilita la scoperta di bersagli molecolari regolati da infiammazione in placente con l'obesità materna.

Un modello di trofoblasto umano primario per studiare l'effetto di infiammazione associata con l'obesità materna sulla regolazione dell'autofagia nella Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Ricerca

Medicina

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Utilizzando la Stimolazione Magnetica Transcranica per studiare il sistema neuromuscolare umano

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

Utilizzando Saccadometry con stimolazione cerebrale profonda per studiare normali e patologiche funzione cerebrale

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Progettazione e sviluppo di un modello per studiare l'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma delle vie aeree della fibrosi cistica

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...