Name: establishing mouse models for zika virus-induced neurological disorders using intracerebral injection strategies: embryonic, neonatal, and adult
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult at JoVE.com

Gli autori desidera ringraziare il Dr. Abdellatif Benraiss presso l'Università di Rochester per il suo mentore e discussioni rilevanti per imparare le tecniche di neonato e adulto chirurgica. Gli autori inoltre desidera ringraziare Dr. James Lauderdale a UGA per l'uso delle sue apparecchiature stereotassiche e discussioni legate alla impostazione della metodologia per questa tecnica e l'avanzamento per la Fondazione di ricerca College scienziati (archi) per loro supporto e il nostro supporto di NIH (NINDS concede & F99NS105187-01 R01NS096176-02, R01NS097231-01).

Tutti gli animali utilizzare protocolli seguire le indicazioni di cura degli animali della University of Southern California e l'Università della Georgia. Metodi di eutanasia per dighe incinte e adulti vengono eseguite secondo protocolli approvati: asfissia di anidride carbonica, seguita da dislocazione cervicale come metodo secondario affinché l'eutanasia. Cuccioli neonatali sono euthanized per decapitazione.
Attenzione: Il seguente protocollo coinvolge manipolano un virus patogeni. Corret...

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	<li>Dreher, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Disease+and+Outcome+in+Children+with+Symptomatic+Congenital+Cytomegalovirus+Infection.">Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection.</a> J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).</li><li>Lanzieri, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+outcomes+of+children+with+symptomatic+congenital+cytomegalovirus+disease.">Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease.</a> J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).</li><li>Naseer, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+WDR62+mutation+causes+primary+microcephaly+in+a+large+consanguineous+Saudi+family.">A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family.</a> Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).</li><li>Abuelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcephaly+Syndromes.">Microcephaly Syndromes.</a> Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).</li><li>Nicholas, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+microcephaly+surveillance+in+the+United+States,+2009+to+2013:+An+analysis+of+potential+sources+of+variation.">Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation.</a> Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).</li><li>Cragan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+Prevalence+of+Birth+Defects+Associated+with+Congenital+Zika+Virus.">Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).</li><li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly.">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li><li>Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+microcephaly+after+Zika+virus+infection+in+Brazil,+2015+to+2016.">Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016.</a> Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).</li><li>Clancy, B., Darlington, R. 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Commun. 8, 14575 (2017).</li><li>Goodfellow, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Induced+Mortality+and+Microcephaly+in+Chicken+Embryos.">Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos.</a> Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+(I).+Isolations+and+serological+specificity.">Zika Virus (I). 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Qui descritto è un metodo per inoculazione intracerebrale della ZIKV per l'indagine sui danni indotti da ZIKV nello sviluppo del cervello nella fase embrionale, neonatale e adulto. Mentre semplice, ci sono alcune considerazioni che gli investigatori devono prendere per garantire la qualità dello studio e la sicurezza delle persone coinvolte.
DENV è collegato strettamente a ZIKV del genere flavivirus. DENV causale non è stato collegato con i disordini cerebrali pediatrici in esseri umani. D...

La microcefalia è una circostanza derivando dallo sviluppo di cervello difettoso caratterizzato da minore dimensione media testa nei neonati. Bambini con microcefalia esibiscono una gamma di sintomi che possono includere ritardo inerente allo sviluppo, il sequestro, disabilità intellettiva, perdita dell'udito, problemi di visione e problemi con il movimento e l'equilibrio, tra gli altri, a seconda della gravità della malattia e causa1,2,3. Questa condizione è multifattoriale in natura, con agente di genetica, infettiva e fattori ambientali legati a causare la microcefalia4,5,6,7,8, 9. Prima dello scoppio del 2015-2016 ZIKV, 8 bambini su 10.000 nascite sono stati diagnosticati con microcefalia negli Stati Uniti secondo il CDC10. Su 1 febbraiost del 2016 l'organizzazione mondiale della sanità ha dichiarato il virus di Zika una preoccupazione di sanità pubblica emergenza di internazionale dovuto l'allarmante aumento nelle diagnosi di microcefalia associata con l'infezione in madri11, ZIKV 12. Un recente studio del CDC su casi ZIKV negli Stati Uniti suggerisce che i risultati di infezione materne ZIKV in un rischio aumentato di 20 volte per un bambino a sviluppare microcefalia rispetto ai soggetti non infetti e il 4% delle madri ZIKV infettati dagli Stati Uniti hanno portato a bambini con microcefalia11. Il tasso di difetti alla nascita associata a microcefalia durante la gravidanza dall'infezione di ZIKV in Brasile sono stati segnalati per avere influenzato fino al 17% dei neonati di madri infette, che indica che altri fattori in America Latina possono contribuire al rischio aumentato 13. mentre sappiamo che la ZIKV può causare microcefalia e patogenesi nei progenitori neurali delle cellule (NPC) popolazione7,8,14, patogenesi completa di ZIKV in via di sviluppo del cervello resta sfuggente. È importante sviluppare modelli animali per indagare ulteriormente i meccanismi di malattia che le anomalie del cervello associate con l'infezione ZIKV.
Per studiare direttamente l'effetto che il ZIKV ha sullo sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato un modello del mouse mediante inoculazione intracerebrale del cervello (e 14.5) 14,5 di giorno embrionale con ZIKV7. Questa fase è stato scelto in quanto è considerato rappresentante della fine del primo trimestre di gestazione umana14. I cuccioli possono sopravvivere fino a giorno postnatale 5 (P5) con questo metodo di iniezione intracerebrale embrionale (~ 1 µ l di 1,7 x 106 coltura tissutale dose infettiva (TCID50/mL)). Questi cuccioli postnatali esibiscono una gamma di fenotipi osservati allo stesso modo nei neonati umani infetti compreso ventricoli allargati, perdita di un neurone, rarefazione assonale, astrogliosis e attivazione microglial12,15. Un cervello di topo neonato è relativamente immaturo, simile allo stadio di sviluppo del cervello umano a metà gestazione16, e lo sviluppo del cervello del mouse include una componente importante di postnatale. Per studiare le infezioni successive fase di gestazione, è anche descritto un metodo per l'infezione postnatale. Neonati infettati con ZIKV P1 sono in grado di sopravvivere fino post-all'iniezione 13 giorni. Infezione anima-nati fase adulta è stata descritta nel topo in precedenza17 ma richiede l'uso di fattori la trascrizione del fattore regolatore (IRF) di interferone (IFN) IRF-3, -5, ceppo di knockout triple-7. Questo protocollo descrive un metodo di inoculazione ZIKV intraventricularly aggirare disabilitando la risposta antivirale del modello murino nell'adulto. Mentre questo elude il sistema immunitario murino, questa via di iniezione non imitare direttamente l'itinerario tipico dell'infezione. Per risolvere questa discrepanza direttamente, lo sperimentatore può eseguire un'infezione intrauterina di ZIKV anziché la route intracranica. Adottata dal precedente lavoro18, abbiamo brevemente descritto questa tecnica in questo protocollo di infezione embrionale.
I ceppi di virus di Zika implementati con questa tecnica includono l'isolato messicano MEX1-447,19 e l'africano isolare MR-766 isolato nel 194720. Zika MEX1-44 è stato isolato in Chiapas, Messico nel gennaio del 2016 da un infetto aegypti di Aedes zanzara. Abbiamo ottenuto questo virus con l'autorizzazione tramite l'Università del Texas Medical Branch a Galveston (UTMB). Inoltre, il sierotipo del virus di febbre rompiossa 2 (DENV2) è stato inoculato con questa tecnica in uno studio di confronto. DENV2, ceppo S16803 (sequenza GenBank GU289914), è stato isolato da un campione clinico dalla Thailandia nel 1974 e attraversate in cellule C6/36. Il virus era attraversato due volte in cellule Vero da centro di riferimento mondiale per i virus emergenti e gli arbovirus (WRCEVA) prima di iniezioni del mouse. Ciò dimostra che questa tecnica funziona altrettanto bene per diversi ceppi di ZIKV e altri flavivirus che possono avere un impatto sullo sviluppo del cervello.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39416001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stereotax</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>04557R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP3 UltraMicroPump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modulamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock tubing (19-gauge)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>90619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melting Point Capillary</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>34500-99</td>
			<td>Glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R25</td>
			<td>No dilution; Use for practice injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, Model 1701 LT SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80001</td>
			<td>for embryonic inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80030</td>
			<td>for neonate/adult</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Ethilon Nylon Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgreen FCF Dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252</td>
			<td>inject with 0.5% Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavivirus group antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6</td>
			<td>DBHB</td>
			<td>Pax6-s</td>
			<td>ms IgG1 1:20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing mouse models for zika virus-induced neurological disorders using intracerebral injection strategies: embryonic, neonatal, and adult

Il virus di Zika (ZIKV) è un flavivirus attualmente endemico in Nord, centro e Sud America. È ormai accertato che il ZIKV può causare microcefalia e le anomalie supplementari del cervello. Tuttavia, il meccanismo alla base della patogenesi della ZIKV nel cervello in via di sviluppo rimane poco chiaro. Metodi chirurgici intracerebral sono frequentemente utilizzati in ricerca in neuroscienza per rispondere alle domande su entrambi lo sviluppo normale e anormale del cervello e la funzione del cervello. Questo protocollo utilizza tecniche chirurgiche classiche e vengono descritti metodi che permettono di malattia neurologica umana ZIKV-collegata di modello nel sistema nervoso del mouse. Mentre l'inoculazione diretta del cervello non modella la normale modalità di trasmissione del virus, il metodo consente gli investigatori a fare domande mirate riguardanti la conseguenza dopo l'infezione di ZIKV del cervello in via di sviluppo. Questo protocollo descrive le fasi embrionali, neonatale e adulte di inoculazione intraventricolare di ZIKV. Una volta imparato, questo metodo può diventare una tecnica semplice e riproducibile che dura solo poche ore per eseguire.

Immagini rappresentative dei nostri metodi di iniezione per l'inoculazione di ZIKV del cervello embrionale sono indicati nei diagrammi raffiguranti intracerebrale iniezioni (Figura 1A) e intrauterina e iniezioni di intraplacental (Figura 1B), che illustrano la modo la diga incinta ed embrioni dovrebbero essere guardati e orientati per la chirurgia (protocollo di inoculazione embrionali). Figura 2A es...

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Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto

Qui descriviamo un metodo per l'instaurazione di un modello di microcefalia indotta da virus di Zika nel topo. Questo protocollo include metodi per inoculazione intracerebrale embrionale, neonatale e adulto-fase del virus Zika.

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

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