Name: establishing mouse models for zika virus-induced neurological disorders using intracerebral injection strategies: embryonic, neonatal, and adult
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult at JoVE.com

Los autores desean reconocer el Dr. Abdellatif Benraiss de la Universidad de Rochester por su tutoría y discusiones relevantes para aprender las técnicas de recién nacido y adulto quirúrgico. Los autores también agradece a Dr. James Lauderdale en UGA para el uso de su equipo estereotáxicas y discusiones relacionadas con ajuste de la metodología de esta técnica y la promoción para la Fundación de investigación Colegio científicos (arcos) para su apoyo y nuestro apoyo de NIH (NINDS becas R01NS096176-02 R01NS097231-01 y F99NS105187-01).

Todo animal use protocolos seguir las pautas de cuidado de los animales de la Universidad de California del sur y la Universidad de Georgia. Métodos de eutanasia para presas embarazadas y los adultos se realizan según protocolos aprobados: asfixia dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical como método secundario para eutanasia. Cachorros neonatales son sacrificados por decapitación.
PRECAUCIÓN: El siguiente protocolo incluye un virus patógeno. Debe tenerse precaución adecua...

<ol>
	<li>Dreher, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Disease+and+Outcome+in+Children+with+Symptomatic+Congenital+Cytomegalovirus+Infection.">Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection.</a> J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).</li><li>Lanzieri, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+outcomes+of+children+with+symptomatic+congenital+cytomegalovirus+disease.">Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease.</a> J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).</li><li>Naseer, M. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population-based+microcephaly+surveillance+in+the+United+States,+2009+to+2013:+An+analysis+of+potential+sources+of+variation.">Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation.</a> Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).</li><li>Cragan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+Prevalence+of+Birth+Defects+Associated+with+Congenital+Zika+Virus.">Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).</li><li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly.">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li><li>Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+microcephaly+after+Zika+virus+infection+in+Brazil,+2015+to+2016.">Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016.</a> Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).</li><li>Clancy, B., Darlington, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+development+in+rodents+and+humans:+Identifying+benchmarks+of+maturation+and+vulnerability+to+injury+across+species.">Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species.</a> Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Infects+Neural+Progenitors+in+the+Adult+Mouse+Brain+and+Alters+Proliferation.">Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).</li><li>Vermillion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrauterine+Zika+virus+infection+of+pregnant+immunocompetent+mice+models+transplacental+transmission+and+adverse+perinatal+outcomes.">Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes.</a> Nat. Commun. 8, 14575 (2017).</li><li>Goodfellow, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Induced+Mortality+and+Microcephaly+in+Chicken+Embryos.">Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos.</a> Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+(I).+Isolations+and+serological+specificity.">Zika Virus (I). Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Shao, Q., Herrlinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+African+Zika+virus+MR-766+is+more+virulent+and+causes+more+severe+brain+damage+than+current+Asian+lineage+and+Dengue+virus.">The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus.</a> Development. , (2017).</li></ol>

Se describe aquí es un método de inoculación intracerebral de la ZIKV en etapas embrionarias, neonatales y adultos para la investigación de los daños inducidos por ZIKV en el desarrollo cerebral. Si bien sencilla, hay algunas consideraciones que los investigadores deben tomar para asegurar la calidad del estudio y la seguridad de los involucrados.
DENV está estrechamente relacionado con ZIKV del género flavivirus. DENV no ha sido causalmente vinculado con trastornos cerebrales pediátri...

Microcefalia es una condición que resulta del desarrollo defectuoso del cerebro caracterizado por más pequeño que el tamaño promedio de la cabeza en los recién nacidos. Los niños con microcefalia muestran un rango de síntomas que pueden incluir el retraso en el desarrollo, convulsiones, discapacidad intelectual, pérdida de la audición, problemas de visión y problemas con el movimiento y el equilibrio, entre otros, dependiendo de la severidad de la enfermedad y causar1,2,3. Esta condición es multifactorial en la naturaleza, con el agente infeccioso, genético y factores ambientales relacionados con causando microcefalia4,5,6,7,8, 9. Antes del estallido de 2015-2016 ZIKV, 8 niños de cada 10.000 nacimientos fueron diagnosticados con microcefalia en los Estados Unidos según la CDC10. 1 de febrero enst de 2016 la Organización Mundial de la salud declaró el virus Zika emergencia salud pública de preocupación internacional debido al alarmante aumento de diagnósticos de microcefalia asociada a infección por ZIKV en madres11, 12. Un estudio reciente de los CDC sobre casos ZIKV en los Estados Unidos sugiere que materna ZIKV infección resulta en un 20-fold riesgo para un niño desarrollar microcefalia en comparación con individuos no infectados y 4% de las madres ZIKV infectado de los Estados Unidos ha resultado en niños con microcefalia11. La tasa de defectos de nacimiento asociados microcefalia durante el embarazo de la infección por ZIKV en Brasil se han divulgado para haber afectado hasta un 17% de los bebés de madres infectadas, indicando que otros factores en América Latina pueden contribuir a un mayor riesgo 13. Si bien sabemos que el ZIKV puede causar microcefalia y patogenesia en progenitoras neurales celular (NPC) población7,8,14, la patogenesia completa de ZIKV en el desarrollo del cerebro sigue siendo elusiva. Es importante desarrollar modelos animales para investigar los mecanismos de la enfermedad que las anomalías cerebrales asociadas con infección por ZIKV.
Para estudiar directamente el efecto que la ZIKV tiene en el desarrollo del cerebro, primero desarrollamos un modelo de ratón con inoculación intracerebral del cerebro de (E14.5) 14,5 día embrionario ZIKV7. Esta etapa fue elegida ya que se considera a representante del final del primer trimestre de gestación humana14. Los cachorros pueden sobrevivir hasta día postnatal 5 (P5) con este método de inyección intracerebral embrionario (~ 1 μl de 1.7 x 106 cultivo de tejidos dosis infectiva (DICT50/mL)). Estos cachorros postnatales muestran un rango de fenotipos similar observado en neonatos humanos infectados incluyendo ventrículos agrandados, pérdida neuronal, axonal vacuo, astrogliosis y microglial activación12,15. El cerebro de un ratón recién nacido es relativamente inmaduro, similar a la etapa de desarrollo del cerebro humano en mitad de la gestación16, y el desarrollo del cerebro del ratón incluye un importante componente postnatal. Para estudiar más adelante infecciones de etapa de gestación, también se describe un método de infección postnatal. Los recién nacidos infectados por ZIKV en P1 son capaces de sobrevivir hasta que después de la inyección 13 días. Infección de la sangre-llevado de la etapa adulta se ha descrito en el ratón previamente17 pero requiere el uso de factores de la transcripción del factor regulador (IRF) de interferón (IFN) IRF-3, -5, cepa-7 triple nocaut. Este protocolo describe un método de inoculación ZIKV intraventricularly para evitar la desactivación de la respuesta antiviral del modelo murino en el adulto. Mientras que esto evita el sistema inmune murino, esta ruta de inyección no directamente mímico la ruta típica de la infección. Para resolver esta discrepancia directamente, el experimentador puede llevar a cabo una infección intrauterina de ZIKV en lugar de la vía intracraneal. Adoptado del anterior trabajo18, hemos descrito brevemente esta técnica en el presente Protocolo de infección embrionaria.
Las cepas de virus Zika implementadas con esta técnica incluyen la cepa mexicana 44 MEX17,19 y el africano aislar Señor-766 aislado en 194720. Zika MEX1-44 fue aislado en Chiapas, México en enero de 2016 de un infectado Aedes aegypti mosquito. Obtuvimos este virus con permiso a través de la rama médica de la Universidad de Texas en Galveston (UTMB). Además, se inoculó el virus del Dengue serotipo 2 (DENV2) utilizando esta técnica en un estudio de comparación. DENV2, cepa S16803 (secuencia de GenBank GU289914), fue aislada de una muestra de paciente de Tailandia en 1974 y pasados en células C6/36. El virus fue pasado dos veces en células Vero por el centro de referencia mundial de virus emergentes y arbovirus (WRCEVA) antes de las inyecciones de ratón. Esto demuestra que esta técnica funciona igualmente bien para diversas cepas de ZIKV y otros flaviviruses que puede tener un impacto en el desarrollo del cerebro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39416001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stereotax</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>04557R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro4 Microsyringe Pump Controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>SYS-MICRO4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UMP3 UltraMicroPump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modulamp</td>
			<td>Schott</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock tubing (19-gauge)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>90619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melting Point Capillary</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>34500-99</td>
			<td>Glass needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R25</td>
			<td>No dilution; Use for practice injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, Model 1701 LT SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80001</td>
			<td>for embryonic inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80030</td>
			<td>for neonate/adult</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Ethilon Nylon Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Grinder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fastgreen FCF Dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252</td>
			<td>inject with 0.5% Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavivirus group antigen antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6</td>
			<td>DBHB</td>
			<td>Pax6-s</td>
			<td>ms IgG1 1:20</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing mouse models for zika virus-induced neurological disorders using intracerebral injection strategies: embryonic, neonatal, and adult

El virus Zika (ZIKV) es un flavivirus actualmente endémico en Norte, centro y Sudamérica. Ahora se ha establecido que el ZIKV puede causar microcefalia y anomalías cerebrales adicionales. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la patogenesia de ZIKV en el cerebro en desarrollo sigue siendo confuso. Métodos quirúrgicos intracerebrales se utilizan con frecuencia en la investigación de la neurociencia para responder preguntas sobre desarrollo normal y anormal del cerebro y la función cerebral. Este protocolo utiliza técnicas quirúrgicas clásicas y describe métodos que permiten modelo ZIKV-asociado humano enfermedad neurológica en el sistema nervioso del ratón. Mientras que la inoculación directa del cerebro no modelo el modo normal de transmisión del virus, el método permite a los investigadores a hacer preguntas específicas sobre la consecuencia después de la infección ZIKV del cerebro en desarrollo. Este protocolo describe etapas embrionarias, neonatales y adulto de la inoculación intraventricular de ZIKV. Una vez dominado, este método puede convertirse en una técnica sencilla y reproducible que sólo tiene unas horas para llevar a cabo.

Imágenes representativas de nuestros métodos de inyección para la inoculación de ZIKV del cerebro embrionario se muestran en diagramas que representan las inyecciones intracerebrales (figura 1A) e intrauterina y intraplacental inyecciones (figura 1B), ilustrando el manera la presa embarazada y embriones deben ser vistos y orientada a la cirugía (Protocolo de inoculación embrionario). Figura 2A ...

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Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Establecimiento de modelos de ratón para trastornos neurológicos inducidos por el Virus Zika utilizando estrategias de inyección Intracerebral: embrionario, Neonatal y adulto

Aquí se describe un método para el establecimiento de un modelo de microcefalia inducida por virus Zika en ratón. Este protocolo incluye métodos para embrionario, neonatal y adulto etapa inoculación intracerebral del virus Zika.

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

Investigación

Neurociencias

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Fundición cerebrovascular del ratón adulto de imágenes en 3D y el análisis morfológico

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

La disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Cargando retrógrada de los nervios, panfletos, y las raíces espinales con tintes fluorescentes

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...