Name: fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections at JoVE.com

Vi er taknemmelige for den jødiske arv fonden Excellence til finansiering af denne forskning. Vi takker Dr. Stuart Williams II for generøst giver brugen af electrospinning system. Vi takker også Dr. Kenneth Palmer for at forsyne os med Griffithsin. Vi takker desuden Dr. Nobuyuki Matoba og hans lab for uddannelse os i GRFT ELISA arbejde.

1. forberedelse og fabrikation af Electrospun Fiber stillads forsigtighed: alt arbejde med opløsningsmidler eller polymer løsninger bør udføres i en kemisk stinkskab . Henvise til materielle sikkerhed dataark hver reagens før du starter protokollen.
<ol><li>Til electrospin en 3 mL 15% w/w PLGA polymer løsning, vejer 720 mg af 50/50 poly (mælkesyre-co-glycolic acid) (PLGA; 0,55 til 0,75 dL/g, 31-57 kDa) i et 10 mL scintillation hætteglas. Volumen af løsningen er baseret p?...

På grund af deres porøse strukturer og store arealer, har EFs fundet en lang række applikationer inden for sundhedssektoren, hvoraf den ene indeholder servering som terapeutisk levering køretøjer. Narkotika og andre stoffer kan være indarbejdet i EFs afstemmelige levering, mens biologics og kemiske ligander kan være konjugeret med fiber overflade for celle-specifikke målretning52 eller biosensing53. Her modificerede fabrikation af GRFT overflade-PLGA EFs, som en lev...

Brugen af EFs som en aktuel leveringsplatform har potentiale til at reducere seksuelt overførte sygdomme. I øjeblikket, er der mere end 36 millioner mennesker lever med HIV, med over to millioner nye tilfælde rapporteret i 2015 alene1,2. Derudover herpes simplex virus type 2 (HSV-2) infektion påvirker hundredvis af millioner af mennesker verden over og har vist sig at forbedre erhvervelse af HIV af 2-5 fold3. På grund af dette forhold mellem HSV-2 infektion og HIV erhvervelse er der betydelig interesse i at udvikle nye aktive agenter, der samtidig beskytter mod flere sexsygdomme. Desuden giver udviklingen af nye køretøjer til at forbedre leveringen af disse antivirale stoffer potentiale til yderligere at styrke beskyttende og terapeutiske styrken. Mod dette mål, er EFs blevet undersøgt som en ny leveringsplatform til at reducere forekomsten af HIV-1 og HSV-2 infektioner.
I løbet af de seneste to årtier, har EFs været flittigt brugt inden for drug delivery og tissue engineering4. Ofte, er biokompatible polymerer udvalgt til at nemt oversætte til terapeutiske anvendelsesmuligheder. For at fabrikere polymere EFs, er valgte polymeren opløst i et organisk opløsningsmiddel eller vandige løsning, afhængigt af graden af polymer hydrophobicity5. Aktive agenter for renter føjes derefter til de opløsningsmiddel eller vandige løsning inden electrospinning processen. Polymer løsning er derefter indsugning i en sprøjte og langsomt skubbet ud under en elektrisk strøm. Denne proces resulterer typisk i polymer fibre med ark eller cylindrisk macrostructures (figur 1) og fiber diametre spænder fra mikro-nano-skala6. Til mest terapeutisk anvendelse, overfladeaktive stoffer er indarbejdet i fibrene under electrospinning processen og er frigivet fra fiber via diffusion og efterfølgende fiber nedbrydning. Sats for nedbrydning eller frigivelse kan ændres ved hjælp af forskellige typer af polymerer eller polymer blander for at etablere en ønskede release profil, bibringe unikke kemiske og fysiske egenskaber7, og at fremme indkapsling af praktisk talt alle sammensatte. Som sådan, EFs har vist sig gavnlig for levering af små molekyle narkotika og biologiske agenser herunder proteiner, peptider, oligonukleotider og vækstfaktorer6,8,9.
I feltet STI forebyggelse, har EFs været brugt for nylig at indarbejde og give vedvarende - eller inducerbar-frigivelse af antivirale stoffer10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. I en af de tidligste undersøgelser, blev pH-responderende fibre udviklet for at frigive overfladeaktive stoffer i reaktion på miljømæssige ændringer inden for den kvindelige forplantningsorganerne (FRT), som en oven på-anfordring metode til beskyttelse mod HIV-111. Siden, har andre undersøgelser undersøgt blandinger af polymere består af polyethylen oxid (PEO) og poly-L-mælkesyre (PLLA), at evaluere afstemmelige udgivelsen af antivirale og svangerskabsforebyggende agenter for HIV-1 forebyggelse og prævention in vitro 12. yderligere undersøgelser har påvist muligheden for EFs at give følgende: forlænget frigivelse af lille molekyle antivirale lægemidler14, stærk og fleksibel mekaniske egenskaber20, 3D-levering arkitekturer21 , hæmning af sperm penetration12, og evnen til at fusionere med andre levering teknologier13. Tidligere arbejde har endelig vurderet polymere fibre for vedvarende levering af antivirale midler mod fælles co-infective virus, HSV-2 og HIV-114. I denne undersøgelse fastsat polymer fibre supplerende aktivitet til antiviral levering af bibeholder deres struktur for op til 1 måned og giver en fysisk viral adgangsbarriere. Fra disse resultater, blev det observeret, at EFs kan bruges til både fysisk og kemisk hindre virusinfektion.
Mens afstemmelige release egenskaber gør polymere EFs en attraktiv leveringsplatform for microbicide levering, er EFs udviklet i andre programmer til at tjene som overflade-modificerede stilladser7. EFs har været brugt til at efterligne morfologi af den ekstracellulære matrix (ECM), ofte optræder som stilladser til at forbedre cellulære regeneration22, og deres nytte i tissue engineering23,24. Fibre består af polymerer såsom poly-ε-caprolactone (PCL) og PLLA har været overflade-modificeret med vækstfaktorer og proteiner efter electrospinning at give ECM-lignende egenskaber, herunder øget cellulær vedhæftning og spredning25 , 26. Derudover antimikrobiel overflade-modificerede EFs er blevet evalueret for at forhindre vækst af bestemte sygdomsfremkaldende bakterier27,28. Denne alsidighed og evnen til at inducere biologiske effekter, EF teknologi fortsætter med at udvide på tværs af en række forskellige områder til at give multi mekanistiske funktionalitet. Endnu, trods deres nytte i en mangfoldighed af applikationer, overflade-modificerede fibre har først for nylig blevet udforsket i microbicide felt29.
Parallelt med udviklingen af nye levering teknologier til forebyggelse og behandling af seksuelt overførte sygdomme er blevet udviklet nye biologiske lægemidler. En af de mest lovende microbicide kandidater er selvklæbende antiviral lektin, GRFT30. Oprindeligt stammer fra en art af rødalger, GRFT har påvist aktivitet som en potent hæmmer af HIV, HSV-2, SARS, og Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. I virkeligheden blandt biologisk baseret hæmmere, GRFT har den mest potente anti-HIV aktivitet, inaktivere HIV-1 næsten umiddelbart efter kontakt30, samtidig opretholde stabilitet og aktivitet i nærværelse af kultur medier fra vaginal mikrober for op til 10 dage37. For nylig, en 0.1% GRFT gel var vist sig at beskytte mus mod intravaginal HSV-2 udfordring, hvilket gør det en lovende kandidat til den første linje af beskyttelse mod både HSV-2 og HIV-132, 38. for HIV specifikt, GRFT hæmmer infektion ved fysisk bindende gp120 eller terminal mannose N-linked glycan rester på virale kuvert overflader til at forhindre indrejse38,39,40,41 ,42. Denne hæmning er yderst potent, med IC50s nærmer sig 3 ng/mL43. Ud over hæmme HIV-infektion, har undersøgelser også vist, at GRFT beskytter mod HSV-2 infektion ved at hæmme celle til celle spredningen af virus32. I alle tilfælde, har GRFT vist sig at være klæbemiddel til viruspartikler, mens demonstrere høj modstand til denaturering. Sidst, GRFT har påvist synergistisk aktivitet med kombinationer af Tenofovir (TFV) og andre antivirale lægemidler44, gør det muligt og sandsynligvis til gavn for Co administrere med EFs. GRFT potente egenskaber gør det en fremragende biologisk baseret antiviral kandidat, hvor levering kan blive styrket med elementærfilen teknologi.
Udnytte denne viden om de klæbende og medfødte antivirale egenskaber af GRFT, var et polymert fiber stillads designet, der integrerer disse egenskaber for at give det første lag af virus løsning hæmning29. Finde inspiration i den måde, at cervicovaginal Slim hæmmer virus transport primært gennem mucoadhesive mucin interaktioner, hypotese vi, der ved hjælp af EFs som et stillads og kovalent ændre overflade med GRFT, en høj tæthed af overflade-konjugeret GRFT ville svække og inaktivere virus på sin entrypoint45,46,47. Her blev EFs udviklet som et stationært stillads til at tilvejebringe en protein-baseret, viral lim-uvirksomme barriere. Vi forsøgte at kombinere de potente antiviral ejendomme af GRFT med en biokompatible, kan ændres og holdbar polymer platform til at skabe en roman virus "fælde."
For at nå disse mål, fibre består af PLGA var electrospun, og EDC-NHS kemi blev brugt til efterfølgende ændre elementærfilen overfladen med GRFT. PLGA fungerede som en model polymer på grund af dens omfattende anvendelse i electrospinning48, kombineret med dens biokompatibilitet og omkostningseffektivitet. Derudover overflade ændring udnytter den store overflade af EFs, og giver et nyttigt alternativ, som kan kombineres med indkapsling at maksimere fiber nytte49. I modsætning til traditionelle indkapsling metoder hvor kun en del af GRFT er tilgængelige (og kun forbigående til stede i FRT), kan overfladen ændring aktiverer GRFT at opretholde maksimal bioactivity under hele varigheden af behandling. Derudover kan indarbejdelse af hydrofile forbindelser såsom proteiner, ved anvendelse af traditionelle electrospinning metoder resultere i lavere indkapsling effektivitet og tab af protein aktivitet50. Derfor, GRFT overflade-modificerede fibre kan tilbyde en lovende alternativ leveringsmetode, der kan bruges alene eller i kombination med electrospinning til at øge beskyttelsen mod STI infektion.

<table style="border-collapse:collapse;width:728pt" width="970">
	<colgroup>
		<col style="width:344pt" width="459" />
		<col style="width:122pt" width="163" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:344pt;height:15.75pt" width="459">Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50</td>
			<td class="xl21" style="width:122pt" width="163">Lactel</td>
			<td class="xl21" style="width:89pt" width="119">B6013-2P</td>
			<td class="xl21" style="width:172pt" width="229"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">147541000</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2</td>
			<td class="xl21">Brico Medical Supplies</td>
			<td class="xl21">BN1815</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">BD 3mL Syringe Luer-lok tip</td>
			<td class="xl21">VWR</td>
			<td class="xl24">309657</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Parafilm (plastic film)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P7793</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">M3671&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sodium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7653</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9333</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="height:15.75pt">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7907</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P0662</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">24500</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">22980</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-Mercaptoethanol</td>
			<td class="xl21">Fisher</td>
			<td class="xl21">BP176</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Griffithsin (GRFT)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td class="xl21">Milipore</td>
			<td class="xl21">317275</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9416&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Tris EDTA Buffer</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">93283</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">3355</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Influenza Hemagglutinin (HA)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">&#160;Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Santa Cruz</td>
			<td class="xl21">2056</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td class="xl21">KPL</td>
			<td class="xl21">52-00-00</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections

Electrospun fibre (EFs) har været meget anvendt i en række terapeutiske applikationer; men de er først for nylig blevet anvendt som en teknologi til forebyggelse og behandling af seksuelt overførte infektioner (Soi). Desuden, mange elementærfilen teknologier fokusere på indkapsling det aktive stof, i forhold til udnytte overflade for at give biofunctionality. Her beskriver vi en metode til at fabrikere og overflade-ændre poly(lactic-co-glycolic) syre (PLGA) electrospun fibre, med den potente antiviral lektin Griffithsin (GRFT). PLGA er en FDA-godkendt polymer, der har været meget anvendt i medicinafgivelse på grund af sin fremragende kemiske og biokompatible egenskaber. GRFT er en naturlig, potent, sikker lektin, som besidder bred aktivitet mod mange vira herunder human immundefekt virustype 1 (HIV-1). Når de kombineres, har GRFT-ændret fibre vist potent inaktivering af HIV-1 i vitro. Dette manuskript beskriver metoder til at fremstille og karakterisere GRFT modificerede EFs. Første er PLGA electrospun til at oprette en fiber stillads. Fibre er efterfølgende overflade-modificeret med GRFT ved hjælp af 1-Ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) og N-hydroxysuccinimide (NHS) kemi. Scanning elektronmikroskopi (SEM) blev brugt til at vurdere, hvilken størrelse og morfologi af overflade-ændrede formuleringer. Derudover en gp120 eller hemagglutinin (HA)-baseret ELISA kan bruges til at kvantificere mængden af GRFT konjugeret med, samt GRFT desorption fra fiber overflade. Denne protokol kan anvendes mere bredt til at fabrikere fibre, der er overfladen-modificeret med en bred vifte af forskellige proteiner.

Fiber morfologi har en betydelig effekt på overfladen-modificerede EFs evne til at yde beskyttelse mod virus. Selv om electrospinning er en bekvem og ukompliceret procedure, kan ikke-optimerede polymer formuleringer medføre uregelmæssig fiber morfologi (figur 5B-C). Ændringer i electrospinning vilkår, der resulterer i dannelsen af beaded eller amorf måttelignende morfologier, er ofte forårsaget af opløsningsmiddel-polymer uforenelighe...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections at JoVE.com

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fremstilling og karakterisering af Griffithsin-ændret Fiber stilladser til forebyggelse af seksuelt overførte infektioner

Dette manuskript beskriver proceduren, at fabrikere og karakterisere Griffithsin modificerede poly (mælkesyre-co-glycolic acid) electrospun fibre, der demonstrerer potent klæbende og antiviral aktivitet mod human immundefekt virus type 1-infektion i vitro. Metoder, der anvendes til at syntetisere, overflade-redigere, karakteriserer den resulterende morfologi, konjugering, og desorption for Griffithsin fra overfladen-modificerede fibre er beskrevet.

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specifikke Modeling of the Heart: Estimering af Ventrikulære fiberorienteringer

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selvrapportering Stilladser for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

Elektrospundne Nanofiber Stilladser med inddeling i Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fremstilling og karakterisering af en Conformal Hud-lignende elektroniske system for kvantitativ, Kutan Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabrikation af mekanisk Tunable og bioaktive Metal Stilladser til biomedicinske anvendelser

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation af ESC-afledt Mouse Airway epitelceller Brug decellulariserede Lung Stilladser

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fremstilling og karakterisering af optiske væv Phantoms indeholdende Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabrikation af Decellularized brusk-afledte Matrix stilladser

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...