Name: fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections at JoVE.com

Wij zijn dankbaar aan het joodse erfgoed Fonds voor uitmuntendheid voor financiering van dit onderzoek. Wij danken Dr. Stuart Williams II royaal voorzien van gebruik van het electrospinning-systeem. Wij danken ook Dr. Kenneth Palmer voor ons te voorzien van Griffithsin. Daarnaast danken we Dr. Nobuyuki Matoba en zijn lab voor opleiding die ons in de GRFT ELISA werken.

1. voorbereiding en fabricage van de steiger van de vezel Electrospun Let op: alle werkzaamheden met oplosmiddelen of Polymeeroplossingen moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast . Verwijzen naar materiële veiligheid gegevensblad van elk reagens voordat het protocol.
<ol><li>Naar electrospin een polymeeroplossing 3 mL 15% w/w PLGA, weeg 720 mg 50:50 poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA; 0,55 tot 0,75 dL/g, 31-57 kDa) in een flesje van 10 mL scintillatie. Het volume van ...

Als gevolg van hun poreuze structuur en een groot oppervlak, hebben EFs gevonden een scala aan toepassingen in de gezondheidszorg, waarvan er één portie als therapeutische leverende voertuigen omvat. Drugs en andere actieve stoffen kunnen worden opgenomen binnen EFs voor afstembare levering, terwijl biologics en chemische liganden kunnen worden geconjugeerd met het oppervlak van de vezel voor cel-specifieke targeting52 of biosensing53. Hier gemodificeerde de fabricage van...

Het gebruik van EFs als een actuele levering-platform heeft de potentie om beduidend te verminderen SOA's. Momenteel zijn er meer dan 36 miljoen mensen met HIV, met meer dan twee miljoen nieuwe gevallen van gemelde in 2015 alleen1,2. Bovendien, herpes simplexvirus type 2 (HSV-2) infectie beïnvloedt honderden miljoenen mensen wereldwijd en is aangetoond dat het verbeteren van de verwerving van HIV door 2-5 voudige3. Vanwege deze relatie tussen HSV-2 infecties en HIV verwerving is er significant belang bij de ontwikkeling van nieuwe werkzame stoffen die gelijktijdige bescherming tegen meerdere SOA's bieden. Bovendien, de ontwikkeling van nieuwe voertuigen ter verbetering van de levering van deze antivirale middelen biedt de mogelijkheid om beschermende en therapeutische potentie verder te verbeteren. Richting van dit doel, zijn EFs onderzocht als een nieuwe levering platform ter vermindering van de prevalentie van HIV-1 en HSV-2 infecties.
Tijdens de afgelopen twee decennia, hebben de EFs uitgebreid op het gebied van drug delivery en weefsel engineering4is gebruikt. Vaak, worden biocompatibel polymeren geselecteerd om gemakkelijk vertalen naar therapeutische toepassingen. Om te fabriceren polymere EFs, wordt het geselecteerde polymeer opgelost in een organisch oplosmiddel of waterige oplossing, afhankelijk van de mate van polymeer hydrophobicity5. Actieve stoffen van belang worden vervolgens toegevoegd aan de oplosmiddelen of waterige oplossing vóór het electrospinning proces. De polymeeroplossing is vervolgens aanzuiging in een spuit en langzaam uitgeworpen terwijl hij onder een elektrische stroom. Dit proces resulteert meestal in polymeer vezels met blad of cilindrische macrostructures (Figuur 1) en vezel diameters variërend van de micro - naar nano-schaal6. Voor de meest therapeutische toepassingen, werkzame stoffen zijn opgenomen in de vezels tijdens het electrospinning en worden vrijgelaten uit de vezel via diffusie en aantasting van de latere vezel. Het tempo van de degradatie of release kan worden gewijzigd met behulp van verschillende soorten polymeren of polymeer combineert om een profiel van de gewenste versie, unieke chemische en fysische eigenschappen7meegeven, en het bevorderen van de inkapseling van vrijwel elk samengestelde. Als zodanig, hebben EFs bewezen gunstig zijn voor de levering van kleine molecuul drugs en biologische agentia zoals eiwitten, peptiden, oligonucleotides en groeifactoren6,8,9.
Op het gebied van STI-preventie, zijn EFs onlangs gebruikt om te nemen en te zorgen voor aanhoudende - of afleidbare-release van antivirale middelen10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In één van de vroegste studies, werden pH-responsieve vezels ontwikkeld om actieve agenten in reactie op veranderingen in het milieu binnen het vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT), vrij te geven als een methode op afroep van bescherming tegen HIV-111. Sinds, hebben andere studies onderzocht polymere blends samengesteld uit polyethyleen oxide (PEO) en poly-L-lactic acid (PLLA), om te evalueren van het afstembare vrijkomen van antivirale en contraceptieve agentia voor HIV-1 preventie en contraceptie in vitro 12. aanvullende studies hebben aangetoond dat de haalbaarheid van EFs te bieden het volgende: verlengd release van klein molecuul antivirale middelen14, sterke en flexibele mechanische eigenschappen20, 3D-levering platforms21 , remming van sperma penetratie12, en de mogelijkheid om te fuseren met andere levering technologieën13. Ten slotte heeft de vorige werk polymere vezels voor de aanhoudende-levering van antivirale middelen tegen gemeenschappelijk co-infective virussen, HSV-2 en HIV-114geëvalueerd. In deze studie geleverd polymeer vezels complementaire activiteit tot antivirale levering door behoud van hun structuur voor maximaal 1 maand en het verstrekken van een fysieke barrière aan virale post. Uit deze resultaten werd naar voren gebracht dat EFs kunnen worden gebruikt voor zowel fysisch en chemisch belemmeren virusinfectie.
Terwijl afstembare release eigenschappen polymere EFs een aantrekkelijke levering platform voor microbiciden levering maken, zijn EFs in andere toepassingen om te dienen als oppervlak gemodificeerde steigers7ontwikkeld. EFs gebruikt om na te bootsen de morfologie van de extracellulaire matrix (ECM), vaak op de hoedanigheid van steigers verbeteren van cellulaire regeneratie22, en verhogen hun nut in weefsel engineering23,24. Vezels bestaat uit polymeren zoals poly-ε-caprolacton (PCL) en PLLA zijn oppervlak-bewerkt met groeifactoren en eiwitten na electrospinning naar ECM-achtige eigenschappen met inbegrip van verhoogde cellulaire hechting en proliferatie25 , 26. Daarnaast antimicrobiële oppervlak gemodificeerde EFs zijn geëvalueerd om te voorkomen dat de groei van specifieke pathogene bacteriën27,28. Door deze veelzijdigheid en de mogelijkheid voor het opwekken van biologische effecten, blijft EF technologie uitbreiden in allerlei velden multi mechanistische functionaliteit te bieden. Nog, ondanks hun nut in een verscheidenheid van toepassingen, oppervlak gemodificeerde vezels hebben pas onlangs onderzocht in het microbicide veld29.
Parallel met de ontwikkeling van nieuwe technologieën van de levering te voorkomen en behandelen van SOA's, nieuwe biologische therapeutics zijn ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende microbicide kandidaten is de zelfklevende antivirale lectine, GRFT30. Oorspronkelijk afkomstig uit een soort van rode algen, GRFT heeft bewezen activiteit als een krachtige remmer van HIV, HSV-2, SARS, evenals het Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. In feite onder biologisch gebaseerde remmers, GRFT heeft de meest krachtige anti-HIV-activiteit, inactiveren HIV-1 bijna onmiddellijk bij contact30, terwijl het handhaven van de stabiliteit en activiteit in aanwezigheid van de voedingsbodems van vaginale microben voor maximaal 10 dagen37. Meer recentelijk, een 0,1% GRFT gel bleek te beschermen tegen intravaginal uitdaging van de HSV-2, waardoor het een veelbelovende kandidaat voor de eerste regel van de bescherming tegen HSV-2 zowel HIV-132 muizen, 38. voor HIV specifiek, GRFT remt infectie door fysiek gp120 of terminal mannose glycan N-gebonden residuen te binden op virale envelop oppervlakken om te voorkomen dat post38,39,40,41 ,42. Deze remming is zeer krachtig, met IC50s 3 ng/mL43naderen. Naast remming van HIV-infectie, hebben studies ook aangetoond dat GRFT tegen HSV-2 infectie beschermt door remming van de cel-naar-cel verspreiding van het virus-32. In alle gevallen, heeft GRFT aangetoond dat het lijm virale deeltjes, worden terwijl de hoge weerstand tegen denaturatie demonstreren. Laatste GRFT heeft aangetoond dat synergetische activiteit met combinaties van Tenofovir (TFV) en andere antivirale middelen44, waardoor het haalbaar en waarschijnlijk gunstig zijn voor mede beheren met EFs. De krachtige eigenschappen van GRFT maken een uitstekende biologisch gebaseerde antivirale kandidaat, waarin de levering kan worden verbeterd met EF-technologie.
Gebruik makend van deze kennis van de zelfklevende en aangeboren antivirale eigenschappen van GRFT, is een polymere vezel-steiger ontworpen, die deze eigenschappen integreert zodat de eerste laag van virus vermelding remming29. Het vinden van inspiratie in de weg dat cervicovaginal slijm virus vervoer voornamelijk door middel van mucoadhesive mucin interacties belemmert, hypothetische wij die met behulp van EFs als een steiger en covalent wijzigen het oppervlak met een hoge dichtheid van GRFT, oppervlakte-geconjugeerde GRFT zou knelpunten en inactivering van virus op haar toegangspunt45,46,47. Hier werden EFs ontwikkeld als een stationaire steiger een op basis van eiwitten, virale lijm-inactiveren barrière platform te bieden. Wij willen combineren de krachtige antivirale eigenschappen van GRFT met een biocompatibele, aanpasbaar en duurzaam polymeer-platform, maak je een roman virus "val".
Om deze doelen te bereiken, werden vezels bestaat uit PLGA electrospun, en EDC-NHS Scheikunde werd gebruikt om vervolgens het wijzigen van het oppervlak van de EF met GRFT. PLGA diende als een model polymeer vanwege haar uitgebreide gebruik in electrospinning48, gecombineerd met de biocompatibiliteit en kosteneffectiviteit. Bovendien, oppervlakte modificatie exploiteert de grote oppervlakte van EFs en biedt een nuttig alternatief dat kan worden gecombineerd met inkapseling te maximaliseren vezel hulpprogramma49. In tegenstelling tot traditionele inkapseling methoden waar slechts een gedeelte van de GRFT is beschikbaar (en slechts Transient presenteren in de FRT), kunnen de oppervlakte wijziging GRFT om maximale topicale tijdens de gehele duur van de behandeling. Bovendien, de opneming van hydrofiele stoffen zoals eiwitten, door traditionele electrospinning methoden, kan resulteren in lagere inkapseling efficiëntie en verlies van eiwit activiteit50. Daarom kunnen GRFT oppervlak gemodificeerde vezels bieden een veelbelovende alternatieve leveringsmethode die alleen of in combinatie met electrospinning kan worden gebruikt ter verbetering van de bescherming tegen SOA-infectie.

<table style="border-collapse:collapse;width:728pt" width="970">
	<colgroup>
		<col style="width:344pt" width="459" />
		<col style="width:122pt" width="163" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:344pt;height:15.75pt" width="459">Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50</td>
			<td class="xl21" style="width:122pt" width="163">Lactel</td>
			<td class="xl21" style="width:89pt" width="119">B6013-2P</td>
			<td class="xl21" style="width:172pt" width="229"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">147541000</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2</td>
			<td class="xl21">Brico Medical Supplies</td>
			<td class="xl21">BN1815</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">BD 3mL Syringe Luer-lok tip</td>
			<td class="xl21">VWR</td>
			<td class="xl24">309657</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Parafilm (plastic film)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P7793</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">M3671&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sodium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7653</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9333</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="height:15.75pt">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7907</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P0662</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">24500</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">22980</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-Mercaptoethanol</td>
			<td class="xl21">Fisher</td>
			<td class="xl21">BP176</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Griffithsin (GRFT)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td class="xl21">Milipore</td>
			<td class="xl21">317275</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9416&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Tris EDTA Buffer</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">93283</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">3355</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Influenza Hemagglutinin (HA)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">&#160;Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Santa Cruz</td>
			<td class="xl21">2056</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td class="xl21">KPL</td>
			<td class="xl21">52-00-00</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections

Electrospun vezels (EFs) hebben op grote schaal gebruikt in een verscheidenheid van therapeutische toepassingen; echter hebben ze pas onlangs zijn toegepast als een technologie ter voorkoming en behandeling van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA's). Bovendien, vele EF technologieën gericht op encapsulating het actieve agens, ten opzichte van het gebruik van het oppervlak te geven biofunctionality. Hier beschrijven we een methode om te fabriceren en oppervlakte-poly(lactic-co-glycolic) zuur (PLGA) electrospun vezels, met de krachtige antivirale lectine Griffithsin (GRFT) te wijzigen. PLGA is een FDA-goedgekeurde polymeer dat wijd verbeid in drug delivery vanwege haar uitstekende chemische en biocompatibel eigenschappen gebruikt is. GRFT is een natuurlijke, krachtige, veilige lectine die bezit brede activiteiten tegen talrijke virussen met inbegrip van humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1). Wanneer gecombineerd, hebben GRFT gemodificeerde vezels potente inactivatie van HIV-1 in vitroaangetoond. Dit manuscript worden de methoden beschreven om te fabriceren en karakteriseren van GRFT gemodificeerde EFs. Ten eerste, is de PLGA electrospun maken van een fiber-steiger. Vezels zijn vervolgens oppervlak-bewerkt met GRFT met 1-Ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) chemie. Scanning elektronen microscopie (SEM) werd gebruikt voor het beoordelen van de grootte en morfologie van oppervlak gemodificeerde formuleringen. Bovendien, een gp120 of hemagglutinine (HA)-gebaseerde ELISA kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de hoeveelheid geconjugeerd met GRFT, evenals GRFT desorptie van het oppervlak van de vezel. Dit protocol kan ruimer worden toegepast om het fabriceren van vezels die oppervlakte-bewerkt met een verscheidenheid van verschillende eiwitten zijn.

Morfologie van de vezel heeft een significant effect op het vermogen van EFs oppervlak gemodificeerde bescherming te bieden tegen virussen. Hoewel electrospinning een handige en eenvoudige procedure is, niet-geoptimaliseerde polymeer formuleringen kunnen leiden tot onregelmatige vezel morfologie (Figuur 5B-C). Wijzigingen in electrospinning omstandigheden die leiden de vorming van kralen of amorfe mat-achtige morphologies tot, worden vaak ver...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections at JoVE.com

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Dit manuscript wordt de procedure beschreven om te fabriceren en karakteriseren van Griffithsin gemodificeerde poly (melkzuur-co-glycolic zuur) electrospun vezels waaruit krachtige lijm en antivirale activiteit tegen humaan immunodeficiëntie virus type 1 infectie in vitro. Methoden die worden gebruikt voor het synthetiseren, oppervlakte-wijzigen, en de resulterende morfologie, conjugatie, karakteriseren en desorptie van Griffithsin van oppervlak gemodificeerde vezels worden beschreven.

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Elastomeer PGS Steigers in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patiënt-specifieke modellering van het Hart: Schatting van ventriculaire vezeloriëntaties

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabricage en karakterisering van een Conformal Skin-achtige Electronic System for Quantitative, Cutane Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabricage van mechanisch afstembare en bioactieve Metal Steigers voor biomedische toepassingen

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabricage en karakterisatie van optische weefsel Phantoms met macrostructuur

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabricage van Decellularized kraakbeen afkomstige Matrix steigers

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...