Name: fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections at JoVE.com

Vi er takknemlige til jødiske Heritage fondet for Excellence for finansiering denne forskningen. Vi takker Dr. Stuart Williams II for sjenerøst gir bruk av electrospinning systemet. Vi takker også Dr. Kenneth Palmer for å gi oss Griffithsin. Vi takker i tillegg Dr. Nobuyuki Matoba og hans lab for trening oss i GRFT ELISA arbeide.

1. forberedelse og fabrikasjon av Electrospun Fiber stillaset Advarsel: alle arbeider med løsemidler eller polymer løsninger skal utføres i kjemisk avtrekksvifte . Se HMS-dataark av hver reagensen før protokollen.
<ol><li>Til electrospin en 3 mL 15% w/w PLGA polymer løsning, veie 720 mg av 50/50 poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA; 0,55 til 0,75 dL/g, 31-57 kDa) i 10 mL scintillation ampuller. Volumet av løsningen er basert på den typiske gruppestørrelse brukes i aktuelle...

Deres porøse strukturer og store flater, har EFs funnet en rekke programmer i helsevesen, hvorav inkluderer som terapeutiske levering biler. Narkotika og andre aktive agenter kan innlemmes i EFs tunable levering, mens biologiske og kjemiske ligander kan bli bøyd på fiber overflaten for celle-spesifikke målretting52 eller biosensing53. Her endret fabrikasjon av GRFT overflaten PLGA EFs, som en levering stillaset å hindre HIV-smitte, er beskrevet. GRFT-EFs ble syntetiser...

Bruk av EFs som en aktuell levering plattform har potensial til å redusere STIs. Foreløpig er det over 36 millioner mennesker lever med HIV, med over to millioner nye tilfeller rapportert i 2015 alene1,2. I tillegg herpes simplex virus type 2 (HSV-2) infeksjon påvirker hundrevis av millioner av mennesker over hele verden og har vist seg å forbedre oppkjøpet av HIV av 2-5 fold3. På grunn av dette forholdet mellom HSV-2 smitte og HIV oppkjøpet er det betydelig interesse for å utvikle nye aktive agenter som beskytter samtidig mot flere STIs. Videre tilbyr utvikling av nye biler å forbedre levering av disse antivirale midler potensial til å forbedre beskyttende og terapeutiske potens. Mot dette målet, har EFs blitt undersøkt som en ny levering plattform å redusere utbredelsen av HIV-1 og HSV-2.
I løpet av de siste to tiårene, har EFs vært mye brukt i narkotika-leveranser og vev engineering4. Ofte velges biokompatible polymerer lett oversette til terapeutiske programmer. For å utvikle polymere EFs, er den valgte polymer oppløst i en organisk løsemiddel eller vandig løsning, avhengig av polymer hydrophobicity5. Aktive agenter rundt legges deretter til løsemiddel eller vandig løsning før electrospinning prosessen. Polymer løsningen er deretter aspirated inn en sprøyte og sakte utløst mens underlagt en elektrisk strøm. Denne prosessen resulterer vanligvis i polymer fiber med ark eller sylindrisk macrostructures (figur 1) og fiber diameter fra mikro - til nano-skala6. For mest terapeutiske programmer, aktive agenter er innlemmet i fibrene under electrospinning prosessen og utgis av fiber via diffusjon og påfølgende fiber degradering. Frekvensen av nedbrytning eller løslate kan endres ved hjelp av ulike polymerer eller polymer blander for å etablere en ønsket utgivelsen profil, formidle unike kjemiske og fysiske egenskaper7, og fremme innkapsling av nesten alle sammensatte. Som sådan, har EFs vist gunstig for levering av små molekyl narkotika og biologiske midler inkludert proteiner, peptider, oligonucleotides og vekstfaktorer6,8,9.
I feltet STI forebygging har EFs nylig brukt å innlemme og gi vedvarende - eller induserbart-release antivirale midler10,11,12,13,14 ,,15,,16,,17,,18,,19. I en av de tidligste studiene, ble pH-responsive fibre utviklet for å frigjøre aktive agenter svar på miljøendringer i den kvinnelige skjede (FRT), som en behovsbetinget metode for beskyttelse mot HIV-1-11. Siden har andre studier undersøkt polymer blander består av polyetylen oksid (PEO) og poly-L-lactic acid (PLLA), for å evaluere tunable utgivelsen av antivirale og prevensjon agenter for HIV-1 forebygging og prevensjon i vitro 12. flere studier har vist muligheten for EFs å gi følgende: langvarig utgivelsen av små molekyl antivirale14, sterk og fleksibel mekaniske egenskaper20, 3D distribusjonsarkitekturer21 , hemming av sæd penetrasjon12og denne muligheten med andre levering teknologi13. Til slutt, tidligere arbeid har vurdert polymere fiber for vedvarende-levering av antivirale midler mot vanlige co-infective virus, HSV-2 og HIV-1-14. I denne studien gitt polymer fiber komplementære aktivitet antiviral levering av beholder strukturen i opptil 1 måned og gir en fysisk barriere viral posten. Fra disse resultatene ble det observert at EFs kan brukes til både fysisk og kjemisk hindre smitte.
Mens tunable utgivelsen egenskaper gjør polymere EFs en attraktiv levering plattform for mikrobicid levering, er EFs utviklet i andre programmer som overflaten endret stillaser7. EFs har blitt brukt til å etterligne morfologi av ekstracellulær matrix (EFM), ofte opptre som stillaser å forbedre mobilnettet fornyelse22, og forbedre deres nytte i vev engineering23,24. Fiber består av polymerer som poly-ε-caprolactone (PCL) og PLLA har vært overflaten endret vekstfaktorer og proteiner etter electrospinning å formidle ECM-lignende egenskaper inkludert økt mobilnettet vedheft og spredning25 , 26. i tillegg antimikrobielle overflaten endret EFs har blitt evaluert for å hindre vekst av bestemte patogene bakterier27,28. Denne allsidigheten og evnen til å indusere biologiske effekter, fortsetter EF-teknologi å utvide over en rekke felt å tilby flere mekanistisk funksjonalitet. Ennå, til tross for sin nytteverdi i et mangfold av programmer, overflate endret fiber har nylig vært utforsket i mikrobicid feltet29.
Parallelt med utviklingen av nye leveringsteknologier for å forebygge og behandle STIs, romanen biologiske therapeutics er utviklet. En av de mest lovende mikrobicid kandidatene er den selvklebende antiviral Lektiner, GRFT30. Opprinnelig stammer fra en art av Rødalger, GRFT har vist aktivitet som en potent inhibitor HIV, HSV-2, SARS, og hepatitt C virus31,32,33,34, 35 , 36. blant biologisk basert hemmere, GRFT har faktisk mest potente anti-HIV aktiviteten, inaktivere HIV-1 nesten umiddelbart etter kontakt30, samtidig opprettholde stabilitet og aktivitet i nærvær av kultur medier fra vaginal mikrober for opptil 10 dager37. Nylig ble en 0,1% GRFT gel vist å beskytte mus mot intravaginal HSV-2 utfordring, gjør det en lovende kandidat for første linje av beskyttelse mot både HSV-2 og HIV-1-32, 38. for HIV GRFT hemmer spesifikt, infeksjon av fysisk bindende gp120 eller terminal mannose N knyttet glycan rester viral konvolutten flater for å unngå oppføring38,39,40,41 ,42. Denne hemming er svært potente, IC50s seg 3 ng/mL43. I tillegg til hemme HIV-smitte, har studier også vist at GRFT beskytter mot HSV-2 infeksjon begrenser celle til celle spredning av virus32. I alle tilfeller har GRFT vist seg å være limet å virus partikler, mens demonstrere høy motstand mot rødsprit. Sist, har GRFT vist samvirkningen med kombinasjoner av Tenofovir (TFV) og andre antivirale44, gjør det mulig og trolig fordelaktig co administrere med EFs. Potent egenskapene for GRFT gjør det en utmerket biologisk basert antiviral kandidat, der levering kan bli styrket med EF-teknologi.
Utnytte denne kunnskapen klebende og medfødte antiviral egenskapene for GRFT, ble en polymere fiber stillaset designet, som integrerer disse egenskaper for å angi det første laget av virus oppføring hemming29. Finne inspirasjon i måten at cervicovaginal Slim hindrer virus transport primært gjennom mucoadhesive mucin vekselsvirkningene, hypotesen vi at ved å bruke EFs som et stillas og covalently endre overflaten med GRFT, en høy tetthet av overflate-konjugerte GRFT ville debilitate og deaktivere virus på sin entrypoint45,46,47. Her ble EFs utviklet som en stasjonær stillaset å gi en protein-basert, viral lim-inaktivere barriere plattform. Vi søkt å kombinere potente antivirale egenskaper for GRFT med en biokompatible modifiserbare og slitesterk polymer plattform, å skape en roman virus "felle".
For å oppnå disse målene, fiber består av PLGA var electrospun, og EDC-NHS kjemi ble brukt senere endre EF overflaten med GRFT. PLGA var en modell polymer sin omfattende bruk i electrospinning48, kombinert med biocompatibility og kostnadseffektivitet. I tillegg overflate endring utnytter den store overflaten av EFs, og gir et nyttig alternativ som kan kombineres med innkapsling å maksimere fiber verktøyet49. I motsetning til tradisjonelle innkapsling metoder hvor bare en del av GRFT er tilgjengelig (og bare transiently tilstede i FRT), kan overflate endring aktivere GRFT å opprettholde maksimal bioactivity under hele varigheten av behandlingen. Videre kan inkorporering av hydrofile forbindelser som proteiner, tradisjonelle electrospinning metoder, resultere i lavere innkapsling effektivitet og tap av protein aktivitet50. Derfor kan GRFT overflaten endret fibre tilby en lovende alternativ leveringsmetode som kan brukes alene eller i kombinasjon med electrospinning for å forbedre beskyttelse mot STI infeksjon.

<table style="border-collapse:collapse;width:728pt" width="970">
	<colgroup>
		<col style="width:344pt" width="459" />
		<col style="width:122pt" width="163" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="width:344pt;height:15.75pt" width="459">Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50</td>
			<td class="xl21" style="width:122pt" width="163">Lactel</td>
			<td class="xl21" style="width:89pt" width="119">B6013-2P</td>
			<td class="xl21" style="width:172pt" width="229"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">147541000</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2</td>
			<td class="xl21">Brico Medical Supplies</td>
			<td class="xl21">BN1815</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl23" height="21" style="height:15.75pt">BD 3mL Syringe Luer-lok tip</td>
			<td class="xl21">VWR</td>
			<td class="xl24">309657</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Parafilm (plastic film)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P7793</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">M3671&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sodium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7653</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium Chloride</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9333</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="height:15.75pt">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">S7907</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P0662</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">24500</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">22980</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">2-Mercaptoethanol</td>
			<td class="xl21">Fisher</td>
			<td class="xl21">BP176</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Griffithsin (GRFT)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td class="xl21">Milipore</td>
			<td class="xl21">317275</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">P9416&#160;</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Tris EDTA Buffer</td>
			<td class="xl21">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl21">93283</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td>
			<td class="xl21">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td class="xl21">3355</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Influenza Hemagglutinin (HA)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Kentucky Bioprocessing</td>
			<td class="xl21">NA</td>
			<td class="xl21">custom made, no product number</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">&#160;Donkey anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)</td>
			<td class="xl21">Santa Cruz</td>
			<td class="xl21">2056</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl21" height="21" style="height:15.75pt">Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td>
			<td class="xl21">KPL</td>
			<td class="xl21">52-00-00</td>
			<td class="xl21"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of griffithsin-modified fiber scaffolds for prevention of sexually transmitted infections

Electrospun fiber (EFs) har vært mye brukt i en rekke terapeutiske programmer. men har de nylig blitt brukt som en teknologi for å forebygge og behandle seksuelt overførte infeksjoner (Soi). Dessuten fokus mange EF teknologier på innkapsle aktive agent, i forhold til utnytte overflaten for å formidle biofunctionality. Her beskriver vi en metode for å dikte og overflaten-endre poly(lactic-co-glycolic) syre (PLGA) electrospun fiber, med den potente antiviral Lektiner Griffithsin (GRFT). PLGA er en FDA-godkjent polymer som har vært mye brukt i narkotika-leveranser på grunn av sin enestående kjemisk og biokompatible egenskaper. GRFT er en naturlig, potent, og trygg Lektiner som har bred aktivitet mot mange virus inkludert humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1). Kombinert, har GRFT endret fiber vist potente inaktivering av HIV-1 i vitro. Dette manuskriptet beskriver metodene for å dikte og karakterisere GRFT endret EFs. Først er PLGA electrospun å lage en fiber stillaset. Fibrene er senere overflaten endret med GRFT bruker 1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) og N-hydroxysuccinimide (NHS) kjemi. Skanning elektronmikroskop (SEM) ble brukt til å vurdere størrelsen og morfologi av overflaten endret formuleringer. I tillegg en gp120 eller hemagglutinin (HA)-basert ELISA kan brukes å kvantifisere mengden GRFT konjugert til, i tillegg til GRFT desorpsjon fra fiber overflaten. Denne protokollen kan brukes mer allment for å utvikle fiber som er overflaten endret med en rekke ulike proteiner.

Fiber morfologi har en betydelig effekt på evnen til overflaten-endret EFs å gi beskyttelse mot virus. Selv om electrospinning er en praktisk og enkel prosedyre, kan ikke-optimalisert polymer formuleringer føre til uregelmessig fiber morfologi (figur 5ABC). Endringer i electrospinning forhold som resulterer i dannelsen av beaded eller amorf mat-lignende morphologies, er ofte forårsaket av løsemiddel-polymer uforlikelighet, lave polymer v...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections at JoVE.com

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Fabrikasjon og karakterisering av Griffithsin endret Fiber stillaser for forebygging av seksuelt overførbare infeksjoner

Dette manuskriptet beskriver fremgangsmåten for å dikte og karakterisere Griffithsin endret poly (lactic-co-glycolic acid) electrospun fiber som demonstrerer potente klebende og antivirale aktivitet mot humant immunsviktvirus type 1 infeksjon i vitro. Metoder for å syntetisere, overflate-endre, karakteriserer den resulterende morfologi, Bøyning, og desorpsjon av Griffithsin av overflaten endret fiber er beskrevet.

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Pasient-spesifikke Modeling of the Heart: Beregning av Ventrikulære Fiber Orientations

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

Elektrospunnede nanofiber Stillas med graderinger i Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabrikasjon og karakterisering av en Conformal Skin-lignende Electronic System for Quantitative, Kutan sårbehandling

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabrikasjon av mekanisk Tunable og Bioaktive Metal Stillas for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generering av MGP-avledet Mouse Airway Epitelceller Bruke Decellularized Lung Stillas

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Fabrikasjon og karakterisering av optisk vev Phantoms som inneholder Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Fabrikasjon av Decellularized brusk-avledet Matrix stillaser

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...